Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 70-й Юбилейной итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 16-18 мая 2011 г.), под ред. В. В. Новицкого, Л. М. Огородовой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2011. − 430 с.

 

Скачать сборник (формат MS Word, 7,3 мб)

Посмотреть основную информацию о сборнике, обложку и т.д.

 

Актуальность. Фермент сукцинатдегирогеназа (СДГ) в митохондриях окисляет янтарную кислоту – альтернативный источник энергообеспечения клетки в экстремальных условиях. Активность СДГ в клетках – важный показатель ответа организма на стресс. Классические способы цитохимической оценки этого показателя содержат заведомо высокую оценку активности этого фермента в покое, что затрудняет выявление истинного уровня ответа на воздействие. Предложен новый метод окраски клеток на митохондриальную СДГ, который на порядок чувствительнее выявляет базовую активность фермента в покое, что позволяет более точно оценить степень изменения активности CДГ  в условиях ответа на стресс [1,2].

Поскольку янтарная кислота не только имеет огромное преимущество в качестве источника энергии в митохондриях над другими субстратами окисления, но и выполняет регуляторную роль в сигнальных путях, отвечающих за выброс адреналина и норадреналина, предложенный метод оценки активности митохондриальной СДГ делает следующее:

1. Упрощает изучение работы гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы;
2. Расширяет возможности фундаментальных исследований;
3. Повышает качество прикладных клинико-диагностических процедур.

Ранее активность  СДГ оценивали субъективно, «вручную», подсчитывая количество гранул в клетке. При новом методе распространение формазана (основного красящего элемента при измерении СДГ) происходит диффузно, и субъективный метод не решает задачи оценки активности фермента.

Целью данной работы было написание макроса к программе ImageJ для объективной количественной оценки активности СДГ. В основе выделения лежит пороговое сегментирование отдельного красного канала RGB изображения клетки, поскольку данный канал наиболее четко отражает накопление активной СДГ в клетке. Сами гранулы видны как фиолетово-черные. Это связано с тем, что при окрашивании используют краситель «нейтральный красный», который окрашивает ядро в красный цвет. При проведении исследования отмечают клетки, которые нужно проанализировать, и запускают макрос, производящий количественный расчет активности СДГ в каждой клетке. Данные заносятся в архив в виде таблицы и могут быть проанализированы в любой статистической программе.

Макрос производит последовательное считывание файлов из папки, в которой содержатся изображения одного исследования. После завершения расчета изображений всей папки отображаются предварительные результаты описательной статистики. Работа модуля была протестирована при разном разрешении изображений и дала высокую сходимость результатов.

Данный модуль позволяет количественно оценить активность СДГ в митохондриях, а также впервые количественно охарактеризовать окисление эндогенной янтарной кислоты.

Кроме того, использование нашего модуля позволило выделить границы цитобиохимических паттернов, характеризующих активность клеточных дегидрогеназ по уровню заполнения клеток (в нашем случае – лимфоцитов) синим пигментом формазаном. Эта методика позволяет дифференцировать активность СДГ  от прочих дегидрогеназ: МДГ (малатдегидрогиназа), α-КНГ (альфа-кетоглутаматдегидрогиназа), ИДГ (изоцитратдегидрогиназа). Для идентификации активности пула отдельных дегидрогеназ в среду добавляли различные дополнительные субстраты, после чего проводили измерение области интересов, количественно отражающей степень окрашенности клетки синим пигментом.

Разработанный автоматический способ количественной оценки активности СДГ был протестирован на кафедре биохимии и молекулярной биологии при исследовании активности сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах крови экспериментальных животных (60 крыс-самцов линии Вистар). Было показано его преимущество перед способом классической субъективной оценки активности фермента.

Выводы: разработанный в ходе настоящего исследования модуль к программе ImageJ позволяет оценить активность внутриклеточной СДГ, при этом учитываются не только гранулы в клетке, но и диффузно распространенный формазан. Это делает исследование активности СДГ более чувствительным и точным по сравнению с классическим общепринятым способом измерения СДГ.