Эта статья опубликована в сборнике статей по материалам XII Российского конгресса молодых  ученых  с  международным  участием "Науки о человеке"  (Томск, 26-27 мая 2011 г.) / под ред.   Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2011. – 104 с. 

Скачать сборник целиком (PDF, 1,6 MB)

В настоящее время потребность в системах эффективного выделения генетического материала высока. Выделение нуклеиновых кислот является необходимым первоочередным этапом реализации биотехнологических манипуляций (в области генной инженерии), клинической диагностики (поли- меразно-цепная реакция, исследования полиморфных генов и т.д.), лечения заболеваний (генотера- пия), а так же широко используется в практике выполнения научных исследований и разработки инновационных продуктов.

Целью настоящей работы было оценить эффективность аффинной сорбции ДНК на частицах нанопорошка композиционного материала SnO₂+Fe₃O₄ и разработать на его основе систему выделения ДНК.

Материал и методы. Композиционный наноматериал SnO₂+Fe₃O₄ был получен на базе Отдела структурной макрокинетики ТНЦ СО РАН методом механохимического синтеза [1]. Суспензию частиц нанопорошка (0,5 мг/мл) получали методом ультразвуковой дезинтеграции (Bandelin). Оценку связывания ДНК (фрагментированная геномная ДНК молок лосося) с частицами нанопорошка проводили в 10 мМ Трис-буфере при варьировании рН (от 3.0 до 8.0) и концентрации солей (NaCl, LiClO₄ от 10 мМ до 5М). Концентрацию ДНК в растворе определяли спектрофотометрическим методом по поглощению при длине волны 260 нм. Для проведения полимеразно-цепной реакции («Тер- цик») использовали праймеры на ген IL-4 человека. С целью контроля выделения ДНК из биологических образцов, а так же продуктов амплификации проводили электрофоретический анализ в 1,5% агарозном геле.

Результаты и обсуждение. Сравнение эффективности адсорбции ДНК при варьировании условий среды показало, что наиболее эффективно молекулы геномной ДНК частицы исследуемого нанопорошка связывали в присутствии 4.8 М перхлората лития. Адсорбционная емкость 1 г частиц композиционного наноматериала SnO₂+Fe₃O₄ в данных условиях составила 140,6±2,7 мг ДНК. Эффективность последующей десорбции ДНК водой с наноматериала достигала 100% (99,1±0,9)%. Был осуществлен подбор оптимального состава компонентов системы (лизирующий, отмывочный, элюи- рующий буферы) и условий обеспечивающих эффективное выделение ДНК из биологического материала (кровь). Анализ возможного отрицательного влияния примесей наносорбента на ПЦР показал, что присутствие в реакционной смеси частиц нанопорошка SnO₂+Fe₂O₃ в концентрациях до 1 мкг/мл не оказывает ингибирующего действия на процесс амплификации.

Заключение. Таким образом, в результате проведенных исследований разработана эффективная система выделения ДНК методом аффинной сорбции на частицах композиционного нанопорошка Sn0₂+Fe₃0₄. Высокая сорбционная емкость наносорбента обеспечивает эффективное выделение генетического материала из биологических образцов. Отсутствие ингибирующего эффекта примесей сорбента на процесс амплификации позволяет снизить вероятность появления ложноотрицательных результатов при клинической диагностике методом ПЦР.