|
Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН, г. Владивосток Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника Введение. В настоящее время уделяется особое внимание разработке медицинских биотехнологий по предотвращению развития заболеваний печени, вызванных воздействием неблагоприятных экологических факторов, стрессовых ситуаций, алкогольных и токсических отравлений. В основе поражений печени, в том числе и алкогольной этиологии, лежат общие фундаментальные механизмы повреждения биологических мембран, связанные с образованием свободных радикалов и, как следствие, активацией перекисного окисления липидов и нарушением функций антиоксидантной системы. Следовательно, целесообразно использовать гепатопротекторы из числа естественных растительных антиоксидантов, способных инактивировать свободные радикалы и предотвращать развитие заболеваний [17].
Как свидетельствуют результаты многочисленных экспериментальных исследований плоды и семена лимонника китайского содержат комплекс лигнанов (схизандрин, схизандрол и др.), обладающий широким спектром биологической активности, проявляющий при этом выраженные гепатопротекторные свойства [9]. Гепатопротекторный эффект лигнанов проявляется в поддержании необходимой концентрации восстановленного глутатиона, повышении активности глутатионтрансферазы [13], содержания аскорбиновой кислоты и α-токоферола [10]. В тоже время, известно о сильном стимулирующем действии плодов лимонника на центральную нервную систему, что ограничивает их применение для лиц с повышенным артериальным давлением и нарушением сердечной деятельности. Однако другие части растения, такие как гребни, хотя и не являются местом локализации лигнанов, содержат при этом комплекс полифенольных соединений с высокой антиоксидантной активностью [3] и их действие на организм практически не изучено.
Целью настоящей работы является оценка эффективности применения полифенольного препарата, полученного из гребней (осевая часть соцветия, освобожденная от ягод) лимонника китайского (Schizandra chinensis), запатентованного как гепатопротектор (патент № 2179031 приоритет от 19.10.2000 г.) и зарегистрированного под торговой маркой «Экликит» (2000721209 от 18.08.2000). В качестве химического агента, модулирующего воздействие экзогенного ксенобиотика, был выбран этиловый спирт, который формирует в организме соответствующую картину метаболического дисбаланса [12]. Препаратом сравнения был выбран гепатопротектор «Легалон» – стандартизованный лекарственный препарат, содержащий в своем составе в качестве активного агента группу флавоноидов из экстракта плодов расторопши пятнистой (Sylibum marianum G.).
Методика. Экстракт из гребней лимонника («Экликит») готовили на 40%-м этиловом спирте методом реперколяции. Выход экстракта составлял 1 л на 1 кг сырья. Готовый спиртовый экстракт упаривали на роторном испарителе без подогрева (t < 20оС) до половины первоначального объема, затем доводили дистиллированной водой до исходного объема и центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин для удаления взвеси. Эксперимент проводили по схеме, приведенной в работе Gajdos A. с соавт. [8] на крысах-самцах Вистар массой 160-180 г, содержавшихся на стандартном рационе питания. Сначала в течение 7 дней крысам внутрибрюшинно 2 раза в сутки вводили 33% этанол в дозе 7,5 мл на 1кг массы тела животного. Затем, после последнего дня введения этанола, внутрижелудочно вводили экликит, в дозе 0,4 мл на 100 г массы в течение 7 дней. Данное количество препарата соответствует дозе, эквивалентной 100 мг/кг олигомерных проантоцианидинов, принятой для проведения токсикологических исследований [6]. Содержание олигомерных проантоцианидинов в исходном экстракте определяли ванилиновым методом [16]. Определение содержания лигнанов методом ВЭЖХ, показало их наличие в экстракте гребней в следовых количествах, что, принимая во внимание их низкую биодоступность, не могло внести существенного вклада в биологическую активность препарата. Дозу для легалона выбирали в соответствии с методическими рекомендациями фирмы изготовителя для проведения токсикологических исследований [2]. Животные были разделены на 5 групп по 8 крыс в каждой: 1-я - контроль (интактная); 2-я - введение 33% этанола; 3-я - введение 33% этанола в течение 7 дней с последующей отменой (депривация) в течение 7 дней; 4-я - введение легалона в дозе 100 мг/кг массы после 7-дневной алкоголизации; 5-я - введение экликита после 7-дневной алкоголизации. Крыс умерщвляли методом декапитации под легким эфирным наркозом.
В гомогенате печени определяли концентрацию никотинамидного кофермента НАД+ [11], лактата [15], активность -глюкозидазы и -галактозидазы [4]. Состояние ситемы антиоксидантной защиты оценивали по активности супероксидисмутазы (СОД) [14] , глутатионредуктазы (ГР) [5] и содержанию восстановленного глутатиона (Г-SH) [7]. Уровень процессов перекисного окисления определяли по содержанию малонового диальдегида (МДА) [1]. Результаты обрабатывали по параметрическому критерию Стьюдента (t).
Результаты и обсуждение. Как видно из таблицы, алкогольная интоксикация, вызванная введением 33% этилового спирта, сопровождается достоверным снижением активности мембраносвязанной лизосомальной β-глюкозидазы на 15% (Р<0,05) по сравнению с контрольными значениями в результате мембраноповреждающего эффекта этанола. Увеличение активности цитозольной β-галактозидазы на 13% (Р<0,05) обусловлено увеличением проницаемости мембран лизосом и выходом матричного фермента. Нарушается соотношение компонентов антиоксидантной защиты. Увеличение активности СОД в 3 раза (Р<0,001) связано с образованием из этанола гидроксиэтильных свободных радикалов, которые активируют микросомальные ферменты монооксигеназной системы. Понижение количества восстановленного глутатиона на 14% (Р<0,05) и активности ключевого фермента его обмена ГР на 61% (Р<0,05) свидетельствует о снижении способности печени эффективно осуществлять детоксикацию. В результате активируется перекисное окисление, что подтверждается увеличением количества МДА на 35% (P<0,05). Уменьшение содержания НАД+ на 49% (Р<0,05), являющегося коферментом алкогольдегидрогеназы, свидетельствует о высокой интенсивности окисления этанола, накоплении восстановленной формы НАДН и, соответственно, нарушении функционирования аэробного гликолиза. Это подтверждается увеличением количества лактата на 42% (Р<0,05), являющегося конечным продуктом анаэробного гликолиза. Обнаруженные изменения изученных биохимических параметров в печени крыс после алкогольной интоксикации свидетельствуют о повышении проницаемости мембран гепатоцитов и гепатотропном действии этилового спирта, которое проявляется в виде существенных сдвигов в углеводном обмене, а также в разбалансировке антиоксидантной системы.
Таблица. Эффективность легалона и экликита при поражении печени этиловым спиртом (М±м). | Биохимические Параметры | 1группа (конт- роль) | 2группа (этанол) | 3группа (депри-вация) | 4группа (депри- вация+ легалон) | 5группа (депри-вация+ экликит) | | β-глюкозидаза (мкмоль/г/мин) | 0,171± 0,01 | 0,146± 0,01* | 0,124± 0,05* | 0,175± 0,01 | 0,172± 0,01 | | β-галактозидаза (мкмоль/г/мин) | 0,395± 0,02 | 0,446± 0,02* | 0,420± 0,01 | 0,340± 0,02 | 0,330± 0,02 | | СОД (ед/мг белка) | 108,5± 11,0 | 344,9± 13,0* | 314,5± 12,3* | 162,6± 11,8* | 126,4± 10,8 | | Глутатионредуктаза (нмоль/мин/мг белка) | 1,31± 0,15 | 0,51± 0,08* | 0,59± 0,09* | 0,86± 0,13* | 1,13± 0,12 | | Восстановленный глутатион (мкг/мл) | 28,2± 0,15 | 24,2± 0,09* | 25,2± 0,16* | 26,6± 0,16* | *28,6± 0,06 | | МДА (мкмоль/г) | 68,91+ 1,7 | 92,94+ 1,4* | 84,93± 1,9* | 69,68± 1,2 | 66,10± 0,8 | | НАД+ (мкмоль/г) | 0,51± 0,04 | 0,26± 0,03* | 0,28± 0,04* | 0,52± 0,03 | 0,62± 0,02* | | Лактат (мкмоль/г) | 6,45± 0,09 | 9,13± 0,35* | 8,03± 0,36* | 7,55± 0,44* | 6,22± 0,19 |
Через 7 дней после отмены этанола (табл., 3 группа) большинство изученных биохимических параметров к норме не возвращается. Остается пониженной на 27% (Р<0,05) активность β-глюкозидазы. Сохраняется рассогласование активности ферментов системы антиоксидантной защиты (увеличение СОД в 2,9 раза, снижение активности ГР на 55%) и пониженное на 11 % (Р<0,05) содержание восстановленного глутатиона. Повышенным на 23% (P<0,05) остается и уровень МДА, что свидетельствует о сохраняющейся активности процессов перекисного окисления липидов. Содержание НАД+ через 7 дней после окончания алкогольной интоксикации остается на уровне такового показателя во 2-й группе, что свидетельствует о сохранении тканевой гипоксии. В связи с этим также зафиксирован увеличенный на 25% (P<0,001) уровень лактата.
Исследования по применению гепатопротекторов легалона и экликита в период отмены этанола показывают, что полученный биологический эффект влияния был в общем идентичен, но в ряде случаев имел разную степень выраженности (4-я и 5-я группы). Так, при действии обоих препаратов нормализовалась активность лизосомальных гидролаз, уровень НАД+. В то же время при действии легалона оставались повышенными количество лактата и активность СОД, пониженными активность ГР и уровень восстановленного глутатиона. При действии экликита эти величины соответствовали контрольному уровню. Обращает на себя внимание факт более высокого содержания НАД+ в печени крыс, получавших экликит (0,62+-0,02 мкмоль/г). При введении легалона эта величина составляла 0,52±0,03 мкмоль/г, что на 18% меньше.
В качестве факторов химической природы был избран, помимо этилового спирта, тиопенталовый наркоз. Тиопентал вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 60 мг на кг массы тела через 2 часа после внутрижелудочного введения легалона (100 мг на кг массы тела) или экликита (0,4 мл на 100 г массы). В контрольной группе гибель составила 25%. В группах животных, получавших растительные препараты, гибели не было. Предварительное введение препаратов сопровождалось снижением времени бокового положения (при введении легалона 42,5+-2,44 мин и при введении экликита 31,6+-2,35 мин против 52,2+-2,28 мин без введения препарата; Р<0,05), что указывает на активацию монооксигеназной системы, осуществляющей биотрансформацию ксенобиотиков. Однако действие экликита было более эффективным, чем таковое при введении легалона.
Выводы:
1. Экликит обладает выраженным гепатозащитным и антиоксидантным действием при алкогольном поражении печени.
2. При введении экликита на фоне алкогольной интоксикации ингибируются свободно-радикальные реакции, и уменьшается образование токсичных продуктов липопероксидации; стабилизируются мембраны лизосом и тормозится выход в цитоплазму гепатоцитов мембранотропных гидролаз.
3. В условиях интоксикации этанолом экликит восстанавливает пул окисленного НАД+, снижая ацидоз и повышая активность процессов энергообеспечения за счет активации аэробного гликолиза.
4. Экликит превосходит эталонный гепатопротектор легалон по способности увеличивать образование окисленной формы НАД+ и восстановленного глутатиона, в большей степени снижать время тиопенталового наркоза. По остальным показателям экликит показывает биологическую активность, равную таковой легалона. Литература
1. Гончаренко М.С., Латинова А.М. /Лаб. Дело. - 1985. - №1 - С. 60-61.
2. Скакун Н.П., Мосейчук И.П. /Врачебное дело. - 1988. - №5. - С. 5-10.
3. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф., Фоменко С.Е. и др. /Бюллетень физиологии и патологии дыхания. – 2002. - №11. – С. 50-53.
4. Покровский А.А., Кравченко Л.В., Тутельян В.А. /Биохимия. – 1971. - 36. – С. 690-696.
5. Юсупова Л.Б. /Лабораторное дело. – 1991. – С. 51-53.
6. Bagchi D., Ray S.D., Patel D., Bagchi M. /Drugs Exp Clin Res. – 2001. - 27. - 3-15.
7. Chau M.-H., Nelson J.W. /FEBS. – 1991. – 291. - 296-298.
8. Gajdos A., Gajdos-Torok M., Horn R. /C R Seances Soc Biol Fil. – 1972. – 166. - 277-279.
9. Hancke J.L., Burgos R.A., Ahumada F. / Fitoterapia . - 70. – 5. - 451-471.
10. Ip S.P., Ko K.M. / Biochemical Pharmacology. – 1996. – 52. – 11. – 1687-1693.
11. Klingenberg M. /Methods of Enzymatic Analysis. – 1984. - Basel, Eds. U.H. Bergmeyers. – 4. - 251-284.
12. Lieber C.S. /Clin Chim Acta. – 1997. - 257. - 59-84.
13. Mak D.H.F., Ko K.M. / Mol. Cell. Biochem. - 1997. - 175. - 1-2. - 225-232.
14. Nishikimi M., Appaji N., Yagi K. /Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1972. - 46. - 849-854.
15. Noll F. /Methods of Enzymatic Analysis. – 1984. - Basel, Eds. U.H. Bergmeyers. – 4. - 582-588.
16. Sun B.S., Ricardo-da-Silva J.M., Spranger I. J. /Agric. Food Chem. – 1998. - 46. - 4267- 4274.
17. Young I.S., Woodside J.V. /J. Clin. Pathol. – 2001. – 54. - 176-186.
|
