Эта работа опубликована в сборнике статей с материалами трудов 2-ой международной телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии". Название сборника "Фундаментальные науки и практика Том 1, №2"

Посмотреть обложку сборника

Скачать информацию о сборнике (в архиве: обложка, тит. лист, оглавление, список авторов)

Скачать сборник целиком можно ЗДЕСЬ

1-НИИ Атеросклероза РАЕН; 

2- Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН;

3- НИИ  экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ, г. Москва.

Резюме.
Для проверки предположения о том, что половые гормоны могут оказывать программирующий эффект на клеточном уровне в отношении способности клеток накапливать холестерин под воздействием атерогенных липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), было проведено сравнительное исследование способности женских и мужских моноцитов и макрофагов накапливать холестерин под воздействием атерогенных ЛПНП. Было установлено, что мужские клетки, как моноциты, так и макрофаги, не отличаются от женских клеток,  ни по исходному содержанию холестерина в клетках, ни по абсолютному приросту холестерина в клетках, ни по относительному содержанию холестерина в клетках. Моноциты, как мужские, так и женские, обладают более высокой способностью накапливать холестерин, чем макрофаги. Наилучшей оценкой способности накапливать холестерин является относительное изменение содержания его в клетках, поскольку не зависит от исходного содержания холестерина. Клетки с исходно повышенным содержанием холестерина обладают более высокой способностью к накоплению избыточного холестерина. В условиях данной тест-системы программирующий эффект половых гормонов выявлен не был.

Введение.
Атеросклероз является распространенной патологией, которую можно рассматривать как дегенеративные изменения артериальной стенки, прогрессирующие с возрастом [1]. Помимо возраста, одним из мажорных факторов развития атеросклероза является половая принадлежность. Прогрессирование атеросклероза у мужчин и женщин  не одинаковое. У мужчин атеросклеротическое изменение сосудистой стенки развивается достаточно рано, и в 50 лет приводит к клиническим проявлениям атеросклеротической болезни [2,3].  У женщин, напротив, прогрессирование атеросклероза начинается в более позднем возрасте и по времени связано с наступлением менопаузы. Поэтому считают, что эстрогены обладают протективным действием на сосудистую стенку у женщин [4,5].
На клеточном уровне инициирующим моментом в атерогенезе является накопление холестерина в клетках артериальной стенки. Липоидоз приводит к формированию пенистых клеток, затем в результате пролиферации или миграции происходит увеличение клеточности и в результате синтетической активности клеток происходит накопление соединительнотканного матрикса [6,7]. Считают, что моноциты периферической крови на ранних этапах атерогенеза мигрируют в субэндотелиальную интиму артерий и, превращаясь в макрофаги, активно участвуют в процессах накопления внутриклеточного холестерина, превращаясь в пенистые клетки, и таким образом, играют существенную роль в атеросклеротических процессах [8].
 Возможно, существуют различия между женскими и мужскими моноцитами и макрофагами в способности накапливать холестерин, т.е. существует программирующий эффект мужских и женских половых гормонов на клеточном уровне. Для проверки этого предположения  было проведено  сравнительное исследование способности женских и мужских моноцитов и макрофагов накапливать холестерин под воздействием атерогенных ЛПНП.

Материалы и методы.
Клетки выделяли из крови здоровых мужчин и женщин в возрасте от 25 до 45 лет методом градиентного центрифугирования. Для формирования градиента плотности использовали среду  LSM (GBO, США). Полученные клетки ресуспендировали в культуральной среде DMEM (GIBCO Europe, Великобритания), содержащей 2 мM L-глютамина, 100 Ед/мл пенициллина и 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Serva, США). Клетки рассаживали в стерильные 48-луночные планшеты для клеточных культур (Nunc, Дания) с плотностью 105 клеток на 1 см2 культуральной поверхности. Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе (5% СО2 и 95% атмосферного воздуха) при 100% влажности и 37ºС. Эксперимент на моноцитах ставили через 24 часа инкубации, на макрофагах через 7 дней инкубации. В день эксперимента культуральную среду заменяли на среду DMEM с 10% липодефицитной сыворотки. К клеткам добавляли ЛПНП в концентрации 100 мкг/мл по белку. В качестве контроля использовали клетки, которые продолжали культивировать в среде без добавления ЛПНП.  Длительность инкубации составляла 3 часа для моноцитов и 12 часов для макрофагов. Липиды экстрагировали с использованием смеси гексан-изопропанол 3:2. В полученном экстракте определяли содержание холестерина ферментативным методом, и нормировали на количество клеточного белка, определяемого по методу Лоури [9].
В ходе эксперимента было измерено исходное содержание холестерина в клетках, содержание холестерина после инкубации с атерогенными ЛПНП, а так же был посчитан абсолютный прирост содержания холестерина в клетках. Накопление холестерина,  индуцированное ЛПНП выражали в процентах от содержания холестерина в контроле (исходные клетки которые не инкубировались с добавлением ЛПНП).
Для статистической обработки результатов использовали программный пакет SPSS 14.0 (SPSS Inc., США). Данные представляли в виде среднего значения с указанием ошибки среднего и стандартного отклонения. Достоверность межгрупповых различий определяли ранговым методом по   U-критерию Манна-Уитни. Достоверность различий при парных сравнениях определялись по Уилкоксону. Различия считали достоверными при вероятности безошибочного прогноза >95 % .

Результаты
Было проведено 68 независимых экспериментов на макрофагах, из них 28 экспериментов было поставлено на мужских клетках, и 40 на женских. Также было проведено 67 независимых экспериментов на монацитах, 38 на мужских клетках и 29 на женских. Обобщенные результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Содержание холестерина в мужских и женских макрофагах и моноцитах, инкубированных с липопротеидами низкой плотности, выделенными из крови больных атеросклерозом.

Из полученных данных следует, что моноциты не отличаются от макрофагов по исходному содержанию холестерина (p=0,187), но накапливают холестерин значительно лучше, чем макрофаги. Для содержания холестерина после инкубации с ЛПНП, абсолютного прироста холестерина и относительного содержания холестерина, показатели достоверности различий между моноцитами и макрофагами составляют p=0,001, p<0,001 и p<0,001, соответственно.
Аналогичная ситуация сохраняется при сравнении моноцитов и макрофагов отдельно у мужчин и женщин. У мужчин показатели достоверности различий между моноцитами и макрофагами (в том же порядке, что и выше) составляют 0,712, 0,067, 0,009 и 0,002. У женщин показатели достоверности различий составляют 0,083, 0,005, <0,001 и <0,001.
Моноциты мужчин и женщин не различаются ни по исходному содержанию холестерина (p=0,830), ни по содержанию холестерина после инкубации с ЛНП (p=0,919), ни по абсолютному приросту холестерина (p=0,556), ни по относительному содержанию холестерина в клетках (p=0,714).
Макрофаги мужчин и женщин не различаются ни по исходному содержанию холестерина (p=0,830), ни по содержанию холестерина после инкубации с ЛНП (p=0,636), ни по абсолютному приросту холестерина (p=0,191), хотя последний показатель и представляется более высоким у мужчин. Однако при оценке относительного изменения содержания холестерина в клетке было установлено, что мужские макрофаги лучше накапливают холестерин, чем женские (p=0,022).
Способность клеток накапливать холестерин прямо связана с исходным содержанием в них холестерина. Для макрофагов коэффициент корреляции между исходным уровнем холестерина и абсолютным приростом холестерина составляет 0,641 (p<0,001), при этом у мужчин r=0,722 (p<0,001), а у женщин r=0,436 (p=0.005). Для моноцитов коэффициент корреляции между исходным уровнем холестерина и абсолютным приростом холестерина составляет 0,431 (p<0,001), при этом у мужчин r=0,526 (p=0,001). Но у женских моноцитов такая взаимосвязь отсутствует: r=0,043 (p=0,825).
Наилучшей оценкой способности клеток накапливать холестерин является относительное изменение содержания холестерина в клетках, т.к. не зависит от исходного содержания холестерина в клетках. Так, коэффициенты корреляции между исходным уровнем внутриклеточного холестерина и его относительным содержанием после инкубации с ЛПНП, составили:  для макрофагов r=0,115 (p=0,349), в том числе для мужских макрофагов r=0,168 (r=0,392), для женских макрофагов r=-0,065 (p=0,691). Для моноцитов r=-0,142 (p=0,250), в том числе для мужских моноцитов r=-0,076 (p=0,652), для женских моноцитов r=-0,340 (p=0,071).
Обсуждение.
В данном исследовании мы установили, что нет различий между женскими и мужскими клетками, как моноцитами, так и макрофагами, по исходному содержанию в них холестерина. Так же не выявлены различия по абсолютному приросту холестерина и по относительному изменению содержания холестерина  в мужских и женских моноцитах и макрофагах.
При этом моноциты, как женские, так и мужские, обладают более высокой способностью накапливать холестерин, чем макрофаги. Способность клеток накапливать холестерин напрямую связано с его исходным содержанием, поскольку клетки с исходно повышенным содержанием холестерина обладают более высокой способностью к накоплению избыточного холестерина. Наилучшей оценкой способности накапливать холестерин является относительное изменение содержания его в клетках, поскольку не зависит от исходного содержания холестерина.
В отечественных и зарубежных исследованиях, направленных на изучение  процессов внутриклеточного накопления холестерина, ранее не изучалась способность клеток накапливать холестерин  в зависимости от половой принадлежности донора.
В большинстве проводимых исследований, направленных на изучение влияния половых гормонов на молекулярно-клеточные механизмы развития атеросклероза, уделяется больше внимание регуляторному эффекту половых гормонов [10,11,12]. Гипотеза о возможном существовании различия между женскими и мужскими моноцитами и макрофагами в способности накапливать холестерин в нашем исследовании не  подтвердилась. Программирующая роль половых гормонов не была установлена. Тем не менее, это не является окончательным заключением, поскольку данная работа имеет определенные ограничения, связанные с использованием конкретной клеточной модели и методологии оценки программирующей роли гормонов.

Список литературы
1.    Chambless L.E., Heiss G., Folsom A.R. et al. Association of Coronary Heart Disease Incidence with Carotid Arterial Wall Thickness and Major Risk Factors: The Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study, 1987–1993. // Am. J. Epidemiol. 1997.-Vol.146.-P.483-494.
2.    Meyer M.R., Haas E., Barton M. Need for research on estrogen receptor function: importance for postmenopausal hormone therapy and atherosclerosis. // Gend. Med. 2008.-Vol.5.-Suppl A.-P.S19-S33.
3.    Jokela H. et al. Fatty acid and cholesterol composition of the uterine artery intima in relation to menopausal status, age, and serum cholesterol. Maturitas 2004.-Vol.47.-P. 115-122.
4.    Herrington, D.M., et al., Effects of estrogen replacement on the progression of coronary-artery atherosclerosis. N Engl J Med, 2000.-Vol.343(8).- P. 522-9.
5.    Collins P. et al. Management of cardiovascular risk in the peri-menopausal woman - a consensus statement of European cardiologists and gynaecologists. Kardiol Pol, 2007. 65: p. 1331-1346.
6.    Герасимова Е.В., Алекберова З.С., Попкова Т.В., Собенин И.А. Атерогенные холестеринсодержащие циркулирующие иммунные комплексы – один из компонентов сыворотки крови больных системной красной волчанкой.  // Клин. мед.-2003.-Т.81.-№9.-С.39-41.
7.    Хавкин Т.Н. О развитии атеросклеротических изменений аорты человека.  // Арх. патол.-1950.-Т.12.-С.23-33.
8.    Andreeva E.R., Orekhov A.N., Smirnov V.N. (Андреева Е.Р., Орехов А.Н., Смирнов В.Н.). Quantitative estimation of lipid-laden cells in atherosclerotic lesions of the human aorta. // Acta Anat. (Basel).-1991.-V.141.-P.316-323.
9.    Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem.-1951.-Vol.193.-P.265-275.
10.    McCrohon, J.A., et al., Androgen receptor expression is greater in macrophages from male than from female donors. A sex difference with implications for atherogenesis. Circulation, 2000. 101(3): p. 224-226.
11.    St Clair, R.W., Effects of estrogens on macrophage foam cells: a potential target for the protective effects of estrogens on atherosclerosis. Curr Opin Lipidol, 1997. 8(5): p. 281-6.
12.    Sulistiyani and R.W. St Clair, Effect of 17 beta-estradiol on metabolism of acetylated low-density lipoprotein by THP-1 macrophages in culture. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997. 17(9): p. 1691-700.