Кемеровская государственная медицинская академия  (г. Кемерово)

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Проблемы и перспективы современной науки" с материалами Четвертой Международной Телеконференции "Фундаментальные науки и практика" - Том 3 - №1. - Томск - 2011.

Актуальность:
В настоящее время перспективным является использование КМБ (костных морфогенетических  белков) для ускорения срастания костей при переломах, однако  в  данном исследовании  предложен вариант использования КМБ для стимуляции роста костей без их предварительного повреждения

Цель исследования:
Проанализировать литературу по данной теме и смоделировать в эксперименте способы удлинения трубчатой  кости малоинвазивным способом.

Дизайн исследования:
Предполагается сформировать следующие группы для дальнейших исследований:
1.    Контрольная группа
2.    Опытные группы:
 а) КМБ 0,8 мг/мл
 б) Стимуляция факторов роста
 в) КМБ 0,8 мг/мл + Стимуляция факторов роста

Методы:
1.    КМБ (костные морфогенетические белки)  в дозе 0,8 мг/мл (доза превышающая рекомендуемую приводит к образованию остеофитов и оссификации мягких тканей) вводится  в дистальный эпифиз бедренной кости
2.    Факторы роста: Васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF), Соматомедин С (инсулиноподобный фактор роста 1 или IGF-1)
Установлено, что на ускорение образования костной ткани можно повлиять двумя путями:
1.    Стимулирование формирования костной ткани :
А) Стимулирование пролиферационной активности остеобластов
2.    Уменьшение костной резорбции:
А) Ингибирование предшественников остеокластов
Б) Уменьшение выведение Са 2+

Факторы,  способствующие росту костной ткани:

1. Для роста костной ткани важное значение имеют особенности кровообращения. Это связано с несколькими механизмами.
-    Кровоток обеспечивает обмен кальция и фосфора между кровью и костной тканью, необходимый для постоянного обновления кости.
Кровоток приносит в костную ткань органические субстраты метаболизма и, прежде всего, глюкозу, высокое потребление которой костной тканью обусловлено низким содержанием в притекающей крови кислорода и гликолитическим путем получения энергии.
     -      Кровь имеет высокое напряжение углекислого газа
-    Кровоток создает в растущей костной ткани электрохимический потенциал, способствующий преципитации солей и образованию очагов кальцификации.

2. Механические нагрузки повышают процессы костеобразования:
Благодаря пьезоэлектрическому эффекту — генерированию потенциалов в местах контакта кристаллов минерального вещества кости (гидроксиаппатита) с органическим веществом — коллагеном.

3. Регуляция роста костей осуществляется гормонами — соматотропином, гормонами щитовидной и половых желез, а также соматомединами или инсулиноподобными факторами роста (ИПФ), один из которых образуется в печени под влиянием соматотропина (ИПФ-1), а другой — (ИПФ-2) — самими хондроцитами хрящевой зоны роста.
При этом соматотропин способствует образованию чувствительных к ИПФ-1 хондроцитов из клеток предшественников, а в дальнейшем, под влиянием ИПФ-1 происходит пролиферация хондроцитов и образование гипертрофированных клеток, уже способных к оссификации.
Рост и дифференцировку остеобластов стимулирует и гормон кальцитриол, основная функция которого заключается в регуляции процессов минерализации.

Характеристика КМБ:
В 1965 г. M. R. Urist впервые сообщил о присутствие в деминерализованной костной ткани остеогеннных белков, способных индуцировать остеогенез при эктопической пересадке. В дальнейших свои работах он показал, что остеогенная активность кости передается через протеиноподобный компонент матрикса, названный костным морфогенетическим белком. [ Urist M.R. Bone: formation by autoinduction./ Urist M.R//Science. – 1965. – Vol. 150.]
В 1988 – 1989 гг. E.A. Wang и др. выделили и очистили  три различных КМБ и охарактеризовали их аминокислотную последовательность. Они представляют собой низкомолекулярные растворимые трансмембранные гликопротеины, существующие в виде димеров, связанных между собой дисульфидными связями. [ Urist M.R. Bone morphogenetc protein induced bone formation and the bone marrow consortium. Urist M.R. // Bone. Transplantation. – Berlin. 1989.]
Для получения достаточного количества КМБ требуется довольно значительный объем костной ткани, поскольку в  1 кг ее содержится примерно 1-2 мг  КМБ.  В последующем были успешно клонированы различные КМБ при помощи рекомбинантных   ДНК, таким образом был получен рекомбинантный человеческий костный морфогенетический белок  - 2 ( рчКМБ  - 2). РчКМБ – 2 представляет собой остеоиндуктивный фактор, который играет основную роль в процессе роста и регенерации костной ткани. E. A. Wang с соавторами первым продемонстрировал возможности рчКМБ – 2 индуцировать костеобразование когда в качестве носителя использовался неактивный деминерализованный крысиный костный матрикс.
    L.S. Poplish  с соавторами представили  результаты своих исследований по устранению небольших костных дефектов у собак с помощью рчКМБ в виде инъекций. Эксперимент проведен на 35 собаках, которым в средней трети обеих локтевых костей формировали дефект размером 3 мм. Животные были разделены на 3 группы: 1 – контрольную составили 13 животных, которым не назначали никакого лечения и выводили из опытов через 4, 8, 12, 16 недель после операций. 2 группа – 11 животных, которым вводили 0,35 рчКМБ на ацетатном буфере в область перелома на одной конечности, в другую конечность вводили только ацетатный буфер. В 3 группе животным в область перелома на одной конечности вводили 0,35 мг  рчКМБ с использованием в качестве носителя карбоксилметилцеллюлоза, а в противоположную конечность только носитель. Животных во 2 и 3 группах выводили из опытов через 4, 8, 12 недель. 4 неделя у всех собак, у которых применяли остеогенный фактор, наблюдалось образование костного регенерата. Полноценное формирование костной структуры отмечалось к 12 недели. В контрольной группе, а также в случаях применения носителей без КМБ, формирование костной мозоли в названные сроки было неполным. Эти данные были подтверждены рентгенологическими, биомеханическими и гистологическими методами. [Poplich L.S. Critical and noncritical size defect healing with osteogenic protein /1997. ]
Наиболее частыми источниками КМБ являются дентин, кость  и ткань остеосаркомы. В настоящее время КМБ и факторы роста применяются в некоторых странах в клинической практике. Однако трудность их выделения и очистки, трудоемкость синтеза методами генной инженерии делают их использование ограниченным. Сейчас в мире биопродукты с применением рекомбинантных белков КМБ - 2 и КМБ -7 производят лишь две зарубежные компании - Medtronic Biologics (ее препарат разрешен к применению с 2002 г.) и Stryker Biotech (ее препарат одобрен FDA в 2001 г.). В России эти препараты не представлены.

Характеристика факторов роста:
1.    Васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF)
Васкулоэндотелиальный фактор - гетеродимерный гликопротеиновый фактор роста продуцируемый различными типами клеток.
VEGF влияет на развитие новых кровеносных сосудов (ангиогенез) и выживание незрелых кровеносных сосудов (сосудистая поддержка), связываясь с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (рецептором-1 VEGF и рецептором-2 VEGF) и активируя их. Эти рецепторы экспрессируются клетками эндотелия стенки кровеносных сосудов. Связывание VEGF с этими рецепторами запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию. Эндотелиальные клетки участвуют в таких разнообразных процессах, как вазоконстрикция и вазодилатация, презентация антигенов, а также служат очень важными элементами всех кровеносных сосудов - как капилляров, так и вен или артерий. Таким образом, стимулируя эндотелиальные клетки, VEGF играет центральную роль в процессе ангиогенеза.

Таблица 1.
Рецепторная специфичность лигандов VEGF и их биологические эффекты

ПлРФ - плацентарный ростовой фактор

Экспрессия VEGF стимулируется множеством проангиогенных факторов, включая эпидермальный ростовой фактор, основной фибробластный ростовой фактор, тромбоцитарный ростовой фактор и интерлейкин-1б. Кроме того, уровни VEGF непосредственно регулируются такими факторами окружающей среды, как рН, давление и концентрации кислорода. VEGF - потенциальный митоген для эпителиальных клеток сосудов. Он оказывает сильное влияние на проницаемость, является мощным ангиогенным белком в различных биологических экспериментах. [Dvorak HF. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a critical cytokine in tumor angiogenesis and a potential target for diagnosis and therapy.  Clinical Oncology 2002]

2. Соматомедин С (инсулиноподобный фактор роста 1 или IGF-1) –одноцепочечный полипептид с молекулярной массой 7 649 Да. Инсулиноподобными эти факторы названы в связи с их способностью стимулировать поглощение глюкозы мышечной и жировой тканью аналогично инсулину.
Синтез его идёт преимущественно (но не только) в печени, стимулируется соматотропным гормоном и приёмом пищи. IGF-1 является гормональным посредником действия на ткани соматотропного гормона. Одним из важных эффектов IGF-1 является стимуляция роста костей в длину. Система инсулиноподобных факторов роста, их связывающих белков и рецепторов участвует в процессах, связанных с ростом и развитием организма, поддержанием нормального функционирования многих клеток организма, обладает выраженным антиапоптотическим эффектом. Это одна из наиболее сложных эндокринных систем организма. Выделено 6 высокоафинных IGF-связывающих белков, активность которых также подвержена регуляции. В крови IGF-1 циркулирует в связанном с белками виде. Время его нахождения в крови больше, чем соматотропного гормона. Одним из важных эффектов IGF-1 является стимуляция роста костей в длину. Циркулирующий IGF-1 повышает чувствительность к инсулину. Сниженный уровень IGF-1 ассоциирован с резистентностью к инсулину (риском развития нарушений углеводного обмена и диабета типа 2). Поскольку IGF-1 играет существенную роль в контроле клеточного цикла и апоптоза (процессах, тесно связанных с механизмами опухолевого роста), в настоящее время интенсивно исследуется его роль в канцерогенезе. При рождении человека IGF-1 в плазме едва определяется, в период детства его уровень градуально растёт, достигая максимума в возрасте от пубертатного периода приблизительно до 40 лет, после чего плавно снижается. Во время беременности уровень IGF-1 в материнской крови увеличивается. Тестирование IGF-1 применяют при диагностике нарушений роста. Во многих случаях уровень IGF-1 является лучшим маркёром для оценки продукции гормона роста. Нормальный уровень соматомедина С в плазме является строгим свидетельством против дефицита соматотропного гормона. Низкий уровень соматомедина С подразумевает дефицит гормона роста и требует дополнительного тестирования уровня соматотропного гормона для выявления его возможного субнормального уровня. [ МакДермотт М. Т. Секреты эндокринологии. М.- СПб.: Бином - Невский Диалект, 2001; Tietz Clinical guide to laboratory tests. ed 4. / Ed. by Wu A.N.B.- USA:W.B Sounders Company, 2006; LeRoith D. and Roberts C. T. The insulin-like growth factor system and cancer - Cancer Letters., 2003, vol. 195, № 2]

3. Физиотерапия:
Низкочастотный ультразвук обладает многообразными лечебными свойствами, связанными с его  антибактериальным, анальгезирующим,
противовоспалительным, спазмолитическим, гипотензивным и общетонизирующим действием. При исследовании воздействия низкочастотного ультразвука частотой 22 кГц на остеогенез выявили стимулирующий эффект на эндохрящевое окостенение
(Korstjens C.M.)
Он оказывает комплексное биологическое воздействие: микромассаж клеточных структур, тепловой эффект, химические воздействия, повышает проницаемость клеточных мембран, улучшает форез лекарственных веществ. Применение низкочастотного ультразвука приводит к реструктуризации костной ткани.
 Еще одним способом  стимуляции остеогенеза является разработанный в Латвийском НИИ травматологии и ортопедии метод воздействия с которым на область поврежденной кости воздействуют импульсным электромагнитным полем с индукцией 0,1-2,0 мТл. При этом возникают собственные колебательные процессы в органе, что усиливает обмен кальция  в кости. Кроме того происходит процесс улучшения кровоснабжения как пораженных так и здоровых окружающих тканей. Это способствует быстрому заживлению органа и может сократить сроки лечения. Однако, положительное влияние электромагнитны импульсов незначительно, так как спектр сформированного электромагнитного поля является несимметричным с максимумом на нулевой частоте, а амплитуда гармоник с возрастанием частоты уменьшается, что ухудшает энергетику спектра.  Известно, что продолжительность воздействия электромагнитного поля ограничивает время адаптации к нему организма, предельная величина которого составляет примерно 40 минут. Поэтому, продолжительные воздействия электромагнитным полем дополнительного эффекта не дает, а только развивает адаптационную реакцию к нему организма, что удлиняет сроки лечения.
    Появились данные о стимулирующем влиянии на остеогенез богатой тромбоцитами плазмы. Если трактовать термин дословно, то обогащенная тромбоцитами плазма – это плазма, концентрация тромбоцитов в которой превышает нормальную. В норме концентрация тромбоцитов в крови колеблется между 150 тыс./мкл и 350 тыс./мкл и в среднем составляет 200 тыс./мкл. Научно доказано, что стимулирующий эффект обогащенной тромбоцитами плазмы проявляется, если концентрация тромбоцитов в ней равна 1.000.000/мкл. Поэтому, на настоящий момент обогащенной тромбоцитами плазмой называют  плазму, если концентрация тромбоцитов в ней равна 1.000.000/мкл. При меньшей концентрации стимулирующий эффект не проявляется, в то же время до сих пор не было показано, что увеличение концентрации тромбоцитов свыше 1.000.000/мкл приводит к дальнейшему ускорению регенерации. При увеличении концентрации тромбоцитов увеличивается концентрация факторов роста. Ниже перечислены семь основных факторов роста, которые содержатся в богатой тромбоцитами плазме: тромбоцитарный фактор роста (PDGF-aa, PDGF-bb, PDGF-ab), трансформирующий фактор роста (TGF-β1, TGF-β2), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактор роста эпителия (EGF). Эти естественные факторы роста находятся в биологически предопределенных соотношениях. Все это отличает богатую тромбоцитами плазму от рекомбинантных факторов роста. Рекомбинантные факторы роста синтезируются культурой яйцеклеток китайского хомяка, в ядро которых с помощью бактериального вектора введен человеческий ген. В результате продуцируется фактор роста одного типа, который затем применяется без синтетического или естественного носителя. В естественном сгустке содержатся фибрин, фибронектин и витронектин, которые еще называют адгезивными молекулами, которые совершенно необходимы для миграции клеток, остеоиндукции, эпителизации и остеоинтеграции. В БоТП эти вещества содержатся в той же концентрации, что и в нормальном сгустке (т.е. 2–4 г/л), именно поэтому БоТП не является фибриновым клеем. Кроме того, БоТП не обладает остеоиндуктивным эффектом, т.е. такая плазма не может инициировать образование кости без присутствия костных клеток. Таким эффектом обладают только костные морфогенетические протеины (КМП), которые способны инициировать образование кости de novo. Однако исследования показали, что при использовании рекомбинантного КМП образуется незрелая кость, причем для ее образования требуется больше времени, чем необходимо в естественных условиях. Возможно, что комбинация БоТП и КМП может значительно усилить активность последнего.

Выводы
-    На основе анализа литературных данных выявлено, что существует перспектива использования КМБ для стимуляции роста кости без повреждения, что является мотивом для дальнейших исследований в этой области.
-    Появились данные о стимулирующем влиянии на остеогенез богатой тромбоцитами плазмы, что может помочь в разработке данного метода. При увеличении концентрации тромбоцитов увеличивается концентрация факторов роста. Возможно, что комбинация богатой тромбоцитами плазмы  и КМБ может значительно усилить активность последнего.