|
Авторы: Рамонова А.А.1, Агапов И.И.1, 2, Мойсенович М.М.1, Богородский С.Э.3, Мусаэлян И.С.3, Попов В.К.3
1Биологический факультет МГУ имени М. В. Ломоносова (г. Москва)
2Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов (г. Москва)
3Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН (г. Троицк, Московская область)
Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Фундаментальные науки и практика" с материалами Третьей Международной Телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии" - Том 1 - №4. - Томск - 2010.
Вискумин – рибосоминактивирующий белок II типа, выделяемый из растения Viscum album, состоит из А- и В-субъединиц, соединенных дисульфидной связью. Молекулярный вес всей молекулы - 60 кДа. Не известны ни роль токсина в развитии омелы, ни причины, определяющие появление других белков этого семейства [1].
Действие РИБ II приводит к остановке белкового синтеза в результате выщеплении остатка аденина из 28S-рРНК эукариот. Данные токсины обладают высокой цитотоксической активностью для клеток млекопитающих - попадания одной молекулы в цитозоль достаточно, чтобы вызвать гибель клетки. ML-токсины (MLI, MLII, MLIII) являются основными белками во всех экстрактах из омелы, которые успешно используются десятки лет при терапии онкологических заболеваний [2,3]. Использование инкапсулированного вискумина может быть более эффективным вследствие пролонгированного выхода из матрицы и длительного действия цитотоксина на опухолевые клетки. В качестве такой матрицы нами был выбран полилактид – нетоксичный универсальный биоразлагаемый полимер. Все эти свойства позволяют использовать полилактид в медицине, в частности в системах контролируемой доставки лекарств. При этом лекарственный препарат инкапсулируют в полимерный носитель и вводят в организм с помощью инъекций или перорально [4,5]. Биодеградация полимерной матрицы приводит к постепенному высвобождению лекарственного препарата. Для инкапсуляции биоактивных веществ в полимерные матрицы обычно используют либо достаточно высокие температуры (до 100°C и выше), либо органические растворители (остатки которых трудно удалить из готового продукта), что приводит к снижению активности самих лекарственных препаратов и изменяет исходные свойства используемого полимера [6]. Применение метода «сухой» сверхкритической флюидной инкапсуляции позволяет проводить инкапсуляцию различных биоактивных компонентов в различные типы аморфных полимеров без потери ими физико-химических и биологических свойств, т.к. не используются жидкие растворители, температура близка к комнатной, а сверхкритическая двуокись углерода легко и практически без остатка удаляется из полимера простым сбросом давления ниже критического значения [7].
В данной работе представлены результаты исследования физико-химических и биологических свойств вискумина, включенного в биорезорбируемую полилактидную матрицу методом «сухой» сверхкритической флюидной инкапсуляции. После высвобождения вискумина из матрицы изучены иммунохимические и цитотоксические свойства данного токсина.
Инкапсуляцию
вискумина в полилактидный носитель проводили на экспериментальной установке [8]
по следующему алгоритму: 0,2 вес.%
(1 мг) порошка
лиофилизированного вискумина, предварительно перемешанного с 0,5 г мелкодисперсного порошка полилактида
(средний размер частиц 10-20 мкм)
загружали в камеру высокого давления. Затем камера уплотнялась и в нее нагнетался
СО2. Температуру камеры поддерживали на уровне 50°C, а температура сопла
составляла около 30°C.
Давление сверхкритического СО2 составляло 10 МПа. Содержимое автоклава тщательно
перемешивали с помощью магнитного смесителя (150 об/мин). Систему выдерживали в этих условиях
в течение 60 минут.
За это время происходила пластификация полимера и его перемешивание с
вискумином. После этого производился импульсно-периодический сброс полученной
смеси и диоксида углерода через сопло в приемную камеру.
После
выдержки полученного продукта в атмосферных условиях в течение 3 часов (необходимой для полного удаления СО2
из частиц полимера и их окончательного затвердевания), собранные частицы
помещали в пластиковые пробирки на 1,5 мл и хранили при температуре -12°C до их дальнейшего
анализа.
Получение
контрольных образцов полимерных частиц, не содержащих вискумина, осуществляли в
аналогичных условиях.
Далее нами были изучены физико – химические и биологические свойства полученных образцов. Вискумин, инкорпорированный в полилактидную матрицу, – порошок, состоящий из пористых микрочастиц размером от 50 до 200 мкм. Анализ данных, полученных методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, позволил определить коэффициент пористости, который составил 22,5 %.
С помощью тест-системы на основе моноклональных антител MNA4 и MNA9 - bi [9] было проведено исследование кинетики выхода вискумина из полилактидной матрицы. По результатам иммуноферментного анализа через 120 часов высвободилось 6,75 % инкапсулированного вискумина.
Цитотоксические свойства высвободившегося из полилактида вискумина оценивали по стандартной методике с использованием МТТ-теста [10]. Тест основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5,-диметилтиозолил-2-ил)-2,5 дифенилтетрозолий бромид (МТТ) до формазана (голубые кристаллы, нерастворимые в воде). Количество образованного формазана прямо пропорционально числу живых клеток. По данным МТТ-теста цитотоксическая активность вискумина, выявленного в анализируемых образцах, остается практически такой же как у токсина, не подвергавшегося дополнительной обработке.
Таким образом, было показано, что включение вискумина в полилактидный носитель методом «сухой» сверхкритической флюидной инкапсуляции не снижает его биологическую активность. Поэтому в перспективе данный метод может быть применён для создания противоопухолевых препаратов направленного пролонгированного действия.
Работа осуществлялась при поддержке Министерства образования и науки Российской федерации в рамках Федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009 - 2013 год" по Государственному контракту № П 407 от 12.05.2010 и частично на средства Российского Фонда фундаментальных исследований (грант № 09-02-00173)
Библиография:
1. H. Niwa, A.G. Tonevitsky, I.I Agapov et. al. // Eur.J.Biochem., 2003, V. 270, P. 2739-2749
2. M. van Wely, M. Stoss, R.W. Gorter // Am.J.Ther., 1999, V. 6, P. 37-43.
3. R. Park, M.S. Kim, H.S. So et. al. // Biochem.Pharmacol., 2000., V. 60, P. 1685-1691.
4. P.S.Kumar, T.R. Saini, D. Chandrasekar et. al. // Drug Deliv., 2007, V. 14, P. 517-523.
5. R.A. Graves, D.Poole, R. Moiseyev et. al. // Drug Dev.Ind.Pharm, 2008, V. 34, P. 419-426.
6. L.G. Griffith // Acta Materialia, 2000, V. 48, P. 263-277.
7. Ф.М. Гумеров, А.Н. Сабирзянов, Г.И. Гумерова // Суб- и сверхкритические флюиды в процессах переработки полимеров, 2000.
8. Е.Н. Антонов, С.Э. Богородский, Б.М. Фельдман и др. // Сверхкритические Флюиды: Теория и Практика, 2008, Т. 3, С. 34-42.
9. A.G. Tonevitsky, I.I. Agapov, D. Temiakov et. al. // Arzneimittelforschung, 1999, V. 49, P. 970-975.
10. T. Mosmann // J.Immunol.Methods, 1983, V. 65, P. 55-63.
|
