Научно-исследовательский институт биологии Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону)

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Фундаментальные науки и практика" с материалами Третьей Международной Телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии" - Том 1 - №4. - Томск - 2010.

Deinococcus radiodurans является одним из самых устойчивых к действию радиации организмом в мире. Он способен выживать при дозе до 10000 Гр [Tian et al., 2007]. Устойчивость D. radiodurans к действию радиации объясняется целым комплексом механизмов [Daly et al., 2004]. Согласно одной из гипотез, радиорезистентность D. radiodurans частично определяется присутствием  в его клетках каротиноида деиноксантина.

Исследования in vitro показали, что деиноксантин обладает уникально высокой антиоксидантной активностью и лучше нейтрализует активные формы кислорода, чем другие каротины (ликопен и β-каротин), или ксантофиллы (зеаксантин и лютеин) [Tian et al., 2007; Krinsky, Johnson, 2005].

Целью нашей работы было исследование защитного эффекта дейноксантина от  действия генотоксических факторов в простейшей тест-системе in vivo, при помощи бактериального lux-биосенсора.

Материалы и методы исследований

Выращивание культуры D. radiodurans ВКПМ B-8209 проводили в 250-мл широкогорлых колбах Эрленмейера с 50 мл среды TGY. Комплекс каротиноидов               D. radiodurans получали методом экстракции органическими растворителями  в сочетании с тонкослойной хроматографией [Лысенко и др., 2010], затем растворяли в оливковом масле.

Для определения биолюминесцентного «ответа» использовали штамм E. coli AB1157 (pRecA-lux), любезно предоставленный И.В. Мануховым (ФГУП «ГосНИИГенетика»). В качестве SOS-промотора в биосенсоре использован PrecA [Zavilgelsky et al., 2007].

Бактерии растили в бульоне Луриа-Бертани (пептон – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, хлористый натрий – 10 г на 1 л раствора; рН – 7.0), содержащем 100 мкг/мл  ампициллина. Клетки выращивали с аэрацией при 30⁰C. Ночную культуру E.coli разводили до концентрации 10⁷ клеток/мл в свежем LB и растили при 37⁰C в течение 2 - 3 часов до ранней экспоненциальной фазы.

Для определения биолюминесцентного «ответа» lux-биосенсора пробы по 160 мкл переносили в специальные кюветы, одна их которых служила контролем (в нее добавляли 40 мкл деионизированной воды), а в другие кюветы вносили по 20 мкл деионизированной воды и 20 мкл раствора мутагена в необходимой концентрации для достижения генотоксического эффекта. Приготовленные пробы с клетками lux-биосенсора помещали в микропланшетный люминометр LM–01T (Immunotech), инкубировали при комнатной температуре, и через определенные интервалы времени измеряли интенсивность биолюминесценции клеточной суспензии. 

Степень индукции (фактор индукции) определяли как отношение интенсивности свечения cуспензии штамма, содержащей тестируемое соединение (Lc), к интенсивности свечения контрольной суспензии штамма (Lk):

I=Lc/Lk

Достоверность отличия биолюминесценции в опыте от контрольной величины оценивали по t-критерию [Лакин, 1990]. Вывод о генотоксичности пробы делали при р<0,05. Если при достоверном отличии опыта от контроля I’<2, обнаруженный генотоксический эффект  оценивали как «слабый», при  2<I’< 10 - как «средний», при 10<I’ -  как «сильный»  эффект.

Принцип определения антимутагенной активности состоит в определении способности дейноксантина подавлять генотоксичность мутагена. При использования биосенсора E. coli AB1157 (pRecA-lux), отвечающего на воздействие ДНК-тропных агентов, в качестве генотоксина использовались диоксидин, (гидроксиметилхиноксилиндиоксид), конечная концентрация которого составила 2,25х10^-5 М; перекись водорода, конечная концентрация которой составила 1х10^-3 М .

Для проведения тестов готовились суспензии масляного экстракта каротиноидов Deinococcus radiodurans в 1 % растворе TWEEN-80 в воде. Протокол определения антимутагенной активности отличается от протокола определения генотоксичности тем, что параллельно в лунки с суспензиями тестерного штамма в количестве 160 мкл добавляли соответствующий токсикант и исследуемый экстракт дейноксантина в количестве 20 мкл в разных концентрациях. В контроле добавляли 20 мкл деионизированной воды и 20 мкл дейноксантина в разных концентрациях.  Также в качестве общего контроля в лунки добавляли 20 мкл деионизированной воды  и 20 мкл 1 % раствора TWEEN-80 в воде. Раствор исследуемого протектора в 1% растворе TWEEN-80 в воде добавляли до необходимой конечной концентрации за 30 мин до внесения токсиканта.

Показатель антимутагенной активности (А, %) рассчитывали как % уменьшения генотоксической активности токсиканта в присутствии изучаемой пробы по следующей формуле:

где: I_a – фактор индукции биолюминесцентного «ответа» lux-биосенсора токсикантами в присутствии антимутагена (каротиноида); Ip – фактор индукции биолюминесцентного «ответа» lux-биосенсоров токсикантами.

Все эксперименты проводили в трех  независимых повторностях.

Результаты и их обсуждение

Как показали полученные результаты, каротиноиды D. radiodurans в концентрациях 0,001–1,0 мкг/мл обладают протекторным эффектом при действии перекиси водорода в концентрации 10^-3 М. В присутствии всех исследованных концентраций дейноксантина было отмечено подавление индукции биолюминесценции штамма E. coli AB1157(pRecA-lux). Для концентрации каротиноидов 1,0 мкг/мл антимутагенный эффект максимален  и составляет 26,32 %.

Антимутагенная  активность  каротиноидов D. radiodurans при действии диоксидина на штамм E. coli AB1157(pRecA-lux) представлена на рисунке.

Рисунок 1 - Антимутагенная активность  каротиноидов D. radiodurans при действии диоксидина в концентрации 2,25·10^-5 М на штамм E. coli AB1157(pRecA-lux)

Из полученных данных  видно, что под действием диоксидина в присутствии  каротиноидов D. radiodurans в концентрациях 0,001–1,0 мкг/мл наблюдалось подавление индукции биолюминесценции штамма E. coli AB1157(pRecA-lux). Максимальное значение протекторной активности достигало 35,96 % (для концентрации 0,1 мкг/мл).

Данные, полученные в результате проведенных исследований при помощи штамма E. coli AB1157(pRecA-lux), свидетельствуют, что препарат каротиноидов Deinococcus radiodurans обладает антимутагенной активностью. Таким образом, бактерии Deinococcus radiodurans могут служить возможным источником комплекса каротиноидов для защиты генетического аппарата человека от деструктивных воздействий генотоксических веществ.

Литература

1.      Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

2.      Лысенко В.С., Чистяков В.А, Зимаков Д.В., Сойер В.Г. Сазыкина М.А., Сазыкина М.И., Сазыкин И.С., Краснов В.П. Разделение и масс-спектрометрическая идентификация каротиноидов радиорезистентных бактерий D. radiodurans // Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7, № 4. С. 71-77.

3.      Daly M.J., Gaidamakova E.K., Matrosova V.Y., Vasilenko A., Zhai M., Venkateswaran A., Hess M., Omelchenko M.V., Kostandarithes H.M., Makarova K.S., Wackett L.P., Fredrickson J.K., Ghosal D. Accumulation of Mn (II) in Deinococcus radiodurans facilitates gamma-radiation resistance // Science.  2004.  № 306. P. 1025–1028.

4.      Krinsky N.I., Johnson E.J. Carotenoid actions and their relation to health and disease // Mol. Aspects Med. 2005.  № 26.  P. 459—516.

5.      Tian В., Xu Z., Sun Z., Li J., Hua Y. Evaluation of the antioxidant effects of carotenoids from Deinococcus radiodurans through targeted mutagenesis, chemiluminescence, and DNA damage analyses //  Biochim. Biophys. Acta. 2007.  V. 1770. № 6. P. 902 – 911.

6.      Zavilgelsky G.B., Kotova V.Yu., Manukhov I.V. Action of 1,1 dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide // Mutat. Res. 2007. V. 634. P. 172–176.