О.Г. Макеев, И.Х. Измайлов, С.В. Костюкова, И.Л. Леонтьев, А.А. Тарасевич, А.В. Воробьев, Ж.Г.Смоляк
Уральская государственная медицинская академия,
Лаборатория молекулярных медицинских технологий СУНЦ РАМН
и Правительства Свердловской области

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

                                        
     Радиационная авария на ПО «Маяк» с выбросом радиоактивных веществ в атмосферу произошла 29 сентября 1957 года. В сферу взрыва было вовлечено свыше 740 ПБк радиоактивных веществ (для сравнения: при аварии на Чернобыльской АЭС – около 1850 ПБк), из которых более 10% было рассеяно в окружающей среде. Осаждение радионуклидов из облака привело к загрязнению территории Челябинской, Свердловской, Курганской и Тюменской областей общей площадью более 23 тыс. км2.
Расположение Восточно-Уральского радиоактивного следа (ВУРС) до сих пор уточняется. Так, согласно карты, положенной в основу Государственной программы по радиационной реабилитации Уральского региона (1992-1995 гг.), г. Каменск-Уральский отнесен от места своего истинного расположения у слияния рек Исеть и Каменка на несколько километров вниз по течению р. Исеть и, тем самым, фактически вынесен за пределы зоны радиоактивного загрязнения. Однако, даже через 40 лет после аварии концентрация 90Sr в образцах почвы, отобранных в городе, соответствовала плотности поверхностного загрязнения территории от 2.2 до 256 ГБк/км2. Уровни загрязнения 137Сs изменялись в пределах 0.74-115 ГБк/км2, составляя в среднем 11 ГБк/км2.
Анализ результатов научных исследований в рамках выполнения Государственных программ Российской Федерации 1992-1995 гг. и 1996-2000 гг. свидетельствует о том, что для жителей Свердловской области так и не удалось показать значимой взаимосвязи между состоянием здоровья населения и расчетными дозовыми нагрузками, полученными населением на территории ВУРС [4, 5]. Для Свердловской области это имело такое последствие, как замораживание финансирования научных программ.
В связи с изложенным, была определена основная цель работы: оценка последствий проживания населения на территории г. Каменск-Уральский и верификация возможной взаимосвязи с известными мутагенными событиями.                    
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
С целью оценки уровня повреждения генетического аппарата в зависимости от степени и продолжительности воздействия составляющих комплексного загрязнения, был выполнен анализ митохондриальной ДНК (мтДНК) из лейкоцитов периферической крови [9] пар мать-дитя у жителей г. Каменск-Уральский, с использованием предварительной амплификации мтДНК путем полимеразной цепной реакции [7]. Степень повреждения мтДНК оценивали путем сопоставления реплицируемых в ходе полимеразной цепной реакции длин локусов ДНК соответствующих пар с инициацией репликации семью праймерами.
Источником информации о заболеваемости населения служили официальные данные, публикуемые в ежегодных изданиях Министерства Здравоохранения Свердловской области (по данным годовых статистических отчетов за 1993-2001 годы) [1]. В качестве базы сравнения статистических показателей использованы данные Свердловской области в целом, что позволило сопоставить еще и направленность изменения показателей.                РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Оценка мутагенеза у жителей г. Каменск-Уральский.                    
Согласно оценок экспертов Научной комиссии по действию атомной радиации ООН, основным последствием ионизирующего излучения при хроническом характере воздействия является повреждение генетического аппарата клеток. Поэтому мы полагали, что прямое исследование ДНК позволит не только оценить степень ее повреждения у населения территории ВУРС Свердловской области, но и очертить патогенетические механизмы нарушения здоровья у современных жителей г. Каменск-Уральский.
Исследовались 2 группы жителей г. Каменск-Уральский. 1-я группа – пары мать-дитя, переселившиеся в город из радиационно благополучных районов (срок проживания в г. Каменск-Уральский 11.50±3.75 года), 2-я группа – коренное население г. Каменск-Уральский – матери, представляющие II поколение, и их дети – III поколение жителей ВУРС (срок проживания на территории города 29.35±5.20 года). Все обследованные женщины родились с 1956 по 1967 гг., а их дети – с 1979 по 1986 гг.
У всех пациентов проводилось клиническое исследование с целью выявления заболеваний, в основе которых могут лежать как наследуемые мутации, так и патология, в патогенезе которой важное место занимает нарушение энергетических и пластических процессов в организме. Количественная оценка заболеваний, связанных с повреждением генома, производилась на основании рекомендаций Международной программы по химической безопасности [2].
Наследование мтДНК по материнской линии предусматривает идентичность последовательности нуклеотидов матери и ребенка. При этом несовпадения последовательности могут возникнуть в результате мутаций мтДНК ребенка и/или матери, произошедших в период после зачатия, и должны отражать относительно недавние мутационные события (возраст ребенка +9 месяцев). Однако данное представление не учитывает важную особенность мутаций мтДНК, описываемую термином «гетероплазмия» (изменение структуры части молекул мтДНК), тем более, что примерно 73% известных фенотипически значимых мутаций мтДНК в той или иной степени являются гетероплазмичными. Такая мутация, однажды возникнув в мтДНК, пребывает в состоянии частичной фиксации – относительно короткого (2-4 поколения) динамичного переходного состояния, обычно завершающегося фиксацией мутации – переходом в состояние гомоплазмии.
В подобных условиях даже кратковременный подъем уровня мутагенности окружающей среды, произошедший на протяжении 2-4 последних поколений, найдет выражение в неидентичности пар нуклеотидов мтДНК в парах мать-дитя, в том числе удаленных от мутагенного инцидента на 30-120 лет. Этому будет способствовать низкий уровень активности репаративных систем мтДНК и более высокие темпы изменчивости митохондриального генома по сравнению с ядерным. Поэтому несовпадение длин локусов мтДНК в парах мать-дитя отражает не только мутагенный фон последних лет, но и мутагенные инциденты, произошедшие за время жизни двух и более поколений.
Оказалось (Табл. 1), что у жителей г. Каменск-Уральского – переселенцев из радиационно благополучных районов (1 группа, 36 пар мать-дитя) заболеваемость матерей составила 36%, в том числе связанная с повреждением генома – 11%, а у детей на момент обследования – 50% и 33% соответственно. Было выявлено 4 случая несовпадения локусов мтДНК в парах мать-дитя (11.11%).
У коренных жителей г. Каменск-Уральский (2 группа, 103 пары) заболеваемость II поколения составила 99.03%, в том числе связанная с повреждением генома – 38%, а III поколения – 141% и 68% соответственно. Выявлено 27 несовпадений локусов мтДНК (26.21%).
Несовпадения последовательности мтДНК пришлись на участки генов, ответственных за синтез комплекса цитохромоксидазы – 14 несовпадений (праймер D1D); НАДН-дегидрогеназы 6 – 9 (D7); тяжелой рибосомальной РНК – 2 (D17); АТФ-синтетазы-3 (D11); дегидрогеназы-2 и 1 (D и DX соответственно). Между тем несовпадения в тех или иных локусах мтДНК не дают оснований связывать их появление с особенностями обследованных групп.
Полученные данные свидетельствуют о наличии прямой зависимости между заболеваемостью, числом несовпадений локусов мтДНК и временем проживания на территории города. Обращает внимание, что заболеваемость матерей в обследованных группах всегда ниже заболеваемости их детей, заболеваемость II поколения коренных жителей превышает таковую у переселенцев, а заболеваемость детей коренных жителей достоверно выше, чем детей женщин, переселившихся из радиационно благополучных районов (во всех случаях р<0.05). При этом, разница между заболеваемостью детей не может быть объяснена исключительно большей подверженностью детского организма действию патогенных факторов, так как все обследованные дети с момента рождения проживали в одном районе города и в равной степени подвергались воздействию факторов окружающей среды.
Более высокая частота встречаемости несовпадений длин локусов мтДНК в группе коренных жителей свидетельствует о том, что наибольший вклад в процесс мутагенеза внесли события, произошедшие до переселения в город первой группы обследованных. Между тем, расчетные константы скорости накопления мутаций у всех обследованных жителей (5.03 и 6.06*10-6 на локус на поколение) существенно превышают аналогичный показатель, рассчитанный по мтДНК А. Уилсоном для современных европейцев (3.14*10-6 на локус на поколение) [8]. Это указывает на сохранение высоких темпов накопления мутаций и в относительно недавний период, прошедший после переселения в город первой группы.
Приведенные данные дают основание предполагать, что мутагенез-индуцирующие факторы в г. Каменск-Уральский действуют в течении жизни более чем одного поколения, а возникающие изменения здоровья накапливаются и передаются из поколения в поколение.
Отсутствие у мтДНК диплоидности и некодирующих участков обеспечивает проявляемость дефекта мтДНК в виде той или иной патологии или наследственного признака. В связи с этим мутация в любом из верифицированных локусов у обследованных лиц способна привести к развитию целого ряда заболеваний, синдромов и патологических состояний за счет торможения синтеза митохондриальных белков и/или нарушения функций ферментов митохондрий, обуславливая снижение энергетического обеспечения организма в зависимости от уровня нарушения. Причем в первую очередь будут страдать пластические процессы энергозависимых систем, таких как системы поддержания постоянства ядерной ДНК (репаративного синтеза), систем, контролирующих рост клеток и постоянство антигенного состава организма и апоптоз, систем, ответственных за элиминацию канцерогенов и препятствующих их проникновению в организм.
Поэтому повреждение мтДНК и, вследствие этого, снижение энергообеспечения адаптационных систем организма к повреждающему действию факторов окружающей среды, может проявиться ростом заболеваемости у групп жителей с наибольшим уровнем повреждения генома. Подтвердить данное предположение способен анализ динамики изменения состояния здоровья населения г. Каменск-Уральский.
                                        
2. Состояние здоровья жителей г. Каменск-Уральский и Свердловской области.            
2.1. Основные демографические параметры и показатели здравоохранения г. Каменск-Уральский.    
Тенденции развития демографических показателей населения Свердловской области и г. Каменск-Уральский за последнее десятилетие сходны. Это относится к ежегодной убыли населения в области (0.50% от числа всех жителей в год) и городе (0.78%), преимущественно вследствие низкой рождаемости (8.40 и 7.52 на 1000 жителей в среднем в год соответственно).
Уровень медицинского обслуживания в области и г. Каменск-Уральский характеризуется близостью показателей работы поликлинической службы (6.6 и 5.9 посещений на одного жителя в среднем в год соответственно), стационарной помощи (0.2341 госпитализированных в области и 0.2592 в городе в расчете на одного жителя в год), а также охвата населения диспансерным наблюдением (22.93% и 24.48% от всего наличного населения области и города соответственно).
В связи с этим, по-видимому, показатели здоровья жителей Свердловской области и г. Каменск-Уральский могут сравниваться без существенных поправок на демографическую ситуацию и качество медицинской помощи.
2.2. Сравнительная характеристика состояния здоровья жителей г. Каменск-Уральский.        
Принятым показателем здоровья населения является заболеваемость, включающая первичную, диагностируемую в год наблюдения, и общую – сумму первичной и заболеваемости, переходящей с предыдущих лет. Последняя, в силу продолжительности течения, в основном, относится к хронической. Если принять во внимание особенность геном-обусловленной патологии, не поддающейся излечению традиционными методами и потому характеризующейся продолжительным течением, то анализ таких заболеваний способен помочь в решении поставленной задачи.
В таблицах 2, 3, 4 представлены данные первичной и хронической заболеваемости детей, подростков и взрослых на 1000 жителей соответствующего возраста (в таблицах данные представлены с 1995 года, так как ранее показатели взрослых и подростков отражались в статистике суммарно).
Первичная заболеваемость детей – жителей области изменяется в пределах от 1151.2 до 1397.3. В г. Каменск-Уральский за все годы наблюдения (1993-2001) первично выявленная патология превышала областную в среднем на 37.5%, а максимум превышения наблюдался в 1994-96 гг. Хроническая патология детей области имеет положительную динамику – с 256.7 (в 1993 г.) до 358. 1 (в 2001 г.). Данные городской службы здравоохранения указывают на то, что встречаемость хронических заболеваний у детей за исключением 2000 г. в основном выше, чем в области (в среднем на 17.4% в год), а наибольшая заболеваемость городских детей была отмечена в 1995 г. (419.7) и в 1996 г. (377.1). Таким образом, максимально высокий уровень как первичной, так и хронической заболеваемости детей города в абсолютных цифрах и по сравнению с данными области зарегистрирован не в последние годы, а в 1994-1996 гг., что соответствует 1981-95 гг. рождения детей. После 1996 г. отмечается неуклонное снижение различий показателей город – область.
Первичная заболеваемость подростков области (720.2 в среднем в год) отличается максимально высоким значением (840.0) в 2000 г., в то время как у подростков города оказывается наивысшей как в 1999, так и в 2000 гг. (1159.2 и 1119.7), а не в 2001 г., когда отмечается ее повсеместное снижение. Важным представляется то, что в 1999 г. зарегистрировано не только максимальное превышение первичной городской заболеваемости подростков над среднеобластным уровнем, но и наибольшее абсолютное её значение в городе за все годы наблюдения. Наивысшие показатели хронической патологии подростков области и города так же приходятся на 1999 г. (565.0 и 661.1 соответственно) при средних годовых значениях заболеваемости 489.8 (в области) и 419.7 (в городе). Частота встречаемости хронической патологии подростков в г. Каменск-Уральский в наибольшей степени превосходит областную в 1998 г. (на 18.9%) и 1999 г. (на 17.0%), но не в 2000 и 2001 гг., когда зарегистрировано ее снижение и в абсолютных цифрах и относительно областного уровня. В связи с этим нельзя не отметить, что наибольшая заболеваемость подростков г. Каменск-Уральский наблюдалась в 1999±1 год. (подростки 1981-85 гг. рождения), а не в 1995-97 гг. и 2001 г.
Первичная заболеваемость взрослых жителей области (Табл. 4) за все годы наблюдения изменяется в относительно узких пределах (от 459.5 до 546.9) в отсутствии выраженной временной динамики. Данный показатель в г. Каменск-Уральский (635.4 в среднем в год) достигает наибольшего уровня в 2000 г. (743.5) и по времени максимума совпадает с таковым в области. Первичная заболеваемость взрослых в г. Каменск-Уральский за все годы наблюдения выше среднеобластного уровня (в среднем на 17.6%) с наиболее существенным превышением (на 36%) в 2000 и 2001 гг. Частота встречаемости хронической патологии у взрослых жителей области (в среднем 461.0) имеет некоторые признаки нарастания с 1997 г. (431.1) к 2001 г. (496.9), что сходно с подобной динамикой, регистрируемой у взрослых жителей города (с 491.0 в 1997 г. до 620.5 в 2001 г.). Превышение хронической патологии взрослых жителей города над показателями области также характеризуется некоторой динамикой нарастания с 7.2% в 1995 г. до 24.9% в 2001 г., а максимальное превышение отмечается в 1998, 2000 и 2001 гг. (на 21.7, 22.6 и 24.9 %% соответственно).
Принимая во внимание возрастную преемственность верифицированных групп населения, мы проанализировали временные взаимосвязи по максимальным превышениям показателей городской заболеваемости. Основным элементом уточняющей датировки явился переход возрастных групп дети-подростки в 14 лет и основной части подростков в группу взрослых в 17 лет (Рис. 1, 2, 3).
Максимум превышения показателей первичной и хронической заболеваемости детей г. Каменск-Уральского приходится на 1995±1 год. Постепенный переход носителей патологии в следующую возрастную группу должен был привести к увеличению заболеваемости подростков, которое наблюдалось в 1999±1 год. Следующий возрастной переход, несмотря на десятикратно более высокую численность взрослых, чем подростков, так же мог сопровождаться некоторым ростом заболеваемости по сравнению с областным уровнем. Это, по-видимому, нашло подтверждение в превышении патологии у взрослых в 2000 и 2001 гг.
Если предположить, что переход детей-носителей максимального уровня патологии в группу подростков произошел в 1997 г. в 14 летнем возрасте и обусловил увеличение носителей патологии у подростков в 1998-99 гг., то год рождения основного числа лиц с максимально высокой заболеваемостью соответствует 1983±1. В свою очередь, если переход большинства подростков – носителей максимального высокого уровня заболеваемости в следующую возрастную группу произошел к 2000 г. (18 лет), то годом рождения таких лиц следует признать 1982±1 год.
Учитывая некоторые допущения, присущие подобного рода расчетам, следует признать, что годы рождения ядра наиболее «больной» группы современных жителей г. Каменск-Уральский находятся в диапазоне от 1981 до 1984 года.
Известно, что наследуемая патология, в основном, является следствием мутаций ДНК половой клетки, а наивысшая чувствительность ооцитов к мутагенному повреждению отмечается в период до и сразу после оплодотворения [6]. Тогда превышение заболеваний, связанных с повреждением генома над территориальным уровнем, может являться индикатором мутагенного воздействия в обозримом прошлом.
Для современных европейцев средний возраст рождения ребенка составляет для женщин 23.7 года и почти 27 лет для мужчин [3, 6]. Если взять за основу продолжения расчетов средний возраст оплодотворения – около 23 лет, то годы рождения матерей группы жителей г. Каменск-Уральский, обусловивших значительное повышение заболеваемости детей, подростков и взрослых в конце прошлого столетия составят 1958-61 гг., а их отцов – на 3 года раньше.
Приведенные вычисления указывают на совпадение периода максимальной радиационной нагрузки на население ВУРС в 1957-1962 гг. и расчетного времени рождения матерей детей – носителей максимального уровня патологии. Период 1957-62 гг. близок и к времени рождения обследованных пар мать (1956-1967 гг. р.) – дитя (1979-1986 гг. р.), у которых зарегистрированы высокие темпы накопления мутаций в митохондриальном геноме, наследуемом исключительно по материнской линии. Это может послужить основой для прогнозирования медицинской ситуации в г. Каменск-Уральский. Так, если расчеты верны, то в ближайшие 2-7 лет можно ожидать рост заболеваемости детского населения города, что уже сейчас дает основание для планирования мероприятий, направленных на повышение репаративной активности системы элиминации повреждений ДНК.                                    
ВЫВОДЫ
1. Несовпадение длин локусов мтДНК в парах мать-дитя может рассматриваться в качестве маркера мутагенеза как III, так и II поколения, дата рождения которого близка к времени максимальной радиационной нагрузки на население (1957-1962 гг.) вследствие аварии на ПО «Маяк» в 1957 г.
2. Высокие темпы накопления мутаций в мтДНК у жителей г. Каменск-Уральский и развивающийся вследствие этого энергодефицит адаптационных процессов могут обуславливать увеличение заболеваемости городского населения. При этом повреждения в ДНК накапливаются и передаются из поколения в поколение.
3. Динамика заболеваемости жителей г. Каменск-Уральский определенно указывает на аварию на ПО «Маяк» в 1957 г. как на основное мутагенное событие, обеспечивающее возрастную преемственность повышения заболеваемости в виде волнообразного ухудшения здоровья, переходящего от младшей к старшим возрастным группам населения города.
4. В ближайшие 2-7 лет в г. Каменск-Уральский можно прогнозировать возрастание заболеваемости детского населения, что дает основание для планирования дополнительных профилактических мероприятий.                  

             
Литература.
1. Состояние здоровья и оказание медицинской помощи населению Свердловской области (по данным годовых статистических отчетов за 1993-2001 годы). Министерство здравоохранения Правительства Свердловской области. Информационные бюллетени за 1994-2002 годы.
2. Международная программа по химической безопасности. Изд.: Всемирная Организация Здравоохранения, Публикация №37, Женева, 1989.
3. Бюллетень ВОЗ. Изд.: Всемирная Организация Здравоохранения, Том 72, №3, Женева, 1994.    
4. Восточно-Уральский радиоактивный след (Свердловская область) / Под ред. проф. В.Н. Чуканова. Екатеринбург: УрО РАН, 1996.
5. Восточно-Уральский радиоактивный след. Проблемы реабилитации населения и территорий Свердловской области. Екатеринбург: УрО РАН, 2000.
6. Фогель Ф., Мотульски А. Генетика человека. В 3-х томах. М.: Мир, 1990.            
7. Armor J. et al. (1988). PSTS for minisattellite 33.1 (D9S49): direct typing by PCR, Nuc. Acids Res. vol. 19, No 17.
8. Cann R. L., Stoneking. M., Wilson F.C. Mitochondrial DNA and Human Evolution. Nature, Vol. 325, No. 6099, pages 31-36; January 1-7, 1987.
9. Southern E.M. (1982). Application of DNA analysis to mapping human genom. Cytogent.cell genet., 32, 52-57.