Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, Новосибирск

Полинуклеарные клетки регистрируются при патологических процессах, обусловливающих развитие многих заболеваний [24; 25; 27], получивших широкое распространение во всем мире [3; 5; 6; 10; 18; 23]. Разработка перспективных методов диагностики и коррекции заболеваний зависит от понимания сути механизмов образования многоядерных клеток и от их связи с причинами, лежащими в основе патологического процесса.
Известно, что формирование полинуклеаров происходит за счет четырех механизмов: в результате слияния одноядерных клеток [21], в случае блокады цитокинеза [32], вследствие многополюсных митозов [31] и при амитотическом делении ядра [28].
В отличие от первых трех, хорошо изученных механизмов, амитоз достаточно редко выступает в качестве объекта исследования, и объем информации по этому вопросу крайне ограничен.
Амитоз имеет важное значение в формировании многоядерных клеток [11; 28; 29] и представляет собой стадийный процесс [8; 9], в ходе, которого последовательно происходят: растяжение ядра, инвагинация кариолеммы, и перетяжка ядра на части [20].
Хотя объем достоверной информации о молекулярных и субклеточных механизмах амитоза недостаточен, но имеются сведения об участии клеточного центра в реализации данного процесса [4]. Также известно, что, если ядра сегментируются благодаря действию микрофиламентов и микротрубочек [22], то роль элементов цитоскелета не исключена и в амитотическом делении.
Прямое деление, сопровождающееся формированием ядер, отличающихся по объему [20; 28] может указывать на несбалансированное распределение хромосомного материала [28], что опровергается данными, полученными в ходе исследований, проведенных с помощью методов световой и электронной микроскопии [9]. Эти противоречия, возможно, свидетельствуют о применении различных методов морфометрического анализа и оценки полученных результатов, лежащих в основе тех или иных выводов.
Регенерация в патологических и в физиологических условиях осуществляется путем амитоза [26], который происходит также при повышении функциональной активности ткани, например, амитозом обусловлено возрастание количества бинуклеарных клеток входящих в состав железистого эпителия молочных желез в период лактации [19]. Поэтому, считать амитотическое деление ядер только признаком патологического характера, следует признать односторонним подходом в изучении данного вопроса, и отвергать факты, подтверждающие компенсаторное значение этого явления.
Амитоз отмечен в клетках различного происхождения [7; 11; 15; 17; 26; 29; 30], включая клетки некоторых опухолей [8; 13; 14; 16], по этому нельзя отрицать его участие в онкогенезе. Высказывается мнение о наличии амитоза в интактных клетках, культивируемых in vitro [17], хотя относить их к таковым возможно лишь условно, поскольку инкубация уже сама по себе является фактором воздействия, меняющим морфологические и функциональные характеристики извлеченных из организма клеток.
О фундаментальном значении амитоза в реализации внутриклеточных процессов говорит факт его существования во многих типах клеток и при разных условиях.
Так как роль амитотического деления полиплоидных ядер в образовании полинуклеаров считается доказанной [28], то в данном случае основной смысл амитоза состоит в установлении оптимальных ядерно-цитоплазматических отношений, позволяющих клеткам адекватно осуществлять разнообразные функции.
Показано существование амитоза в многоядерных клетках различного происхождения [11; 17; 26; 29] и их образование за счет нескольких механизмов [12; 20], в том числе, и вследствие амитотического деления ядра [7].
Обобщая представленную информацию можно сделать вывод о том, что амитоз, в результате которого образуются полинуклеары, имеет стадийный характер и принимает участие в обеспечении адекватного функционирования клеток и тканей организма в физиологических и патологических условиях.
Однако объем информации об особенностях формирования многоядерных фибробластов в результате амитотического деления их ядер в зависимости от воздействия различных факторов, вероятно, нельзя признать достаточным. В то же время получение таких данных необходимо для понимания многих аспектов функционирования и формообразования этих клеток. Широкое распространение заболеваний соединительной ткани [1; 2] определяет актуальность подобного рода исследований.
Целью исследования была оценка влияния условий инкубации культур фибробластов на активность амитотического процесса.
Формировали следующие экспериментальные группы фибробластов: со сниженной до 22 С температурой инкубации; со сниженной в два раза концентрацией посадки клеток; с добавлением по 0,3 мл кондиционной среды на флакон, полученной в результате инкубации клеток линии Hep-2 или фибробластов линии L929 (в течение 7 суток); с внесением по 20 мкг/мл липополисахарида или по 0,3 мл взвеси перитонеальных клеток (выделенных от мышей линии BALB/c) на флакон. Контролем служили интактные клеточные культуры.
Клетки инкубировали при температуре 370 С. Препараты фиксировали 50 % раствором этанола и окрашивали азур – эозином. Концентрация посадки составляла 100 тыс. фибробластов перевиваемой линии L929 в 1мл взвеси. Проводили определение частоты встречаемости одноядерных и многоядерных фибробластов с признаками амитотического деления ядер, подсчитывали количество клеток в состоянии митоза. Результаты оценивали через 48 часов от начала инкубации.
При снижении температуры инкубации культур фибробластов количество многоядерных фибробластов с признаками амитотического деления ядер возрастало относительно контрольного уровня в 4,6 раза. В отношении одноядерных фибробластов данная тенденция не наблюдалась. Эти различия были обусловлены функциональными особенностями клеток, и связаны с меньшей устойчивостью многоядерных фибробластов по отношению к изменению температуры инкубации.
В группе культур с низкой концентрацией посадки фибробластов отмечали уменьшение митотической активности в 1,9 раза по сравнению с контрольным уровнем. В этой группе культур количество многоядерных фибробластов с признаками амитоза было в 2,1 раза больше, чем в контрольной группе. При этом амитотическому делению подвергалось, как правило, только одно из ядер в многоядерной клетке. Частота встречаемости одноядерных клеток в состоянии амитоза не имела межгрупповых различий. Подавление митотической активности можно объяснить недостаточным уровнем влияния регуляторных факторов, который наблюдается в условиях низкой концентрации фибробластов в культурах. Многоядерные клетки были, вероятно, более чувствительны к неблагоприятным условиям инкубации, чем одноядерные, что и обусловило значительное увеличение частоты встречаемости полинуклеарных фибробластов с признаками амитоза.
Добавление в культуры фибробластов кондиционной среды, полученной в результате инкубации фибробластов и клеток культуры Нер-2 не вызывало достоверного изменения частоты встречаемости клеток в состоянии амитоза по сравнению с контролем. При этом признаки амитотического деления ядра отмечали только в многоядерных фибробластах, а наблюдаемой формой амитоза, как правило, было отпочковывание фрагмента от одного из ядер. Приведенные данные указывают на отсутствие активизации амитотического процесса в следствии добавление кондиционной среды в клеточные культуры.
Внесение липополисахарида в клеточные культуры индуцировало увеличение частоты встречаемости многоядерных фибробластов в состоянии амитоза в 1,4 раза. При совместной инкубации фибробластов с перитонеальными клетками наблюдали возрастание количества многоядерных фибробластов, имеющих признаки амитотического деления ядер, в 2 раза. Независимо от групповой принадлежности культур фибробластов отмечали наличие лишь единичных одноядерных клеток с признаками амитотического деления ядра. Присутствие липополисахарида в клеточных культурах и совместная инкубация фибробластов с перитонеальными клетками вызывали активизацию амитотического процесса только в полинуклеарных фибробластах, что, вероятно, объясняется их большей функциональной лабильностью к действию указанных факторов, по сравнению с одноядерными.
Таким образом, используемые условий инкубации фибробластов, включая: изменение температурного режима и концентрации посадки клеток, а также внесение липополисахарида и совместная инкубация с перитонеальными клетками, вызывали активизацию амитотического процесса только в многоядерных фибробластах. Полученные результаты могут применяться для дальнейшей разработки экспериментальных моделей in vitro, которые будут полезны при изучении влияния условий инкубации клеток соединительной ткани на активность течения митотического и амитотического процессов.

 

Список литературы:
1.Насонова В.А., Астапенко М.Г. Клиническая ревматология - М.: Медицина, 1989. - 592 с.
2. Adebajo A.O., Alegbeleye J.A. Cross cultural aspects of rehabilitation in rheumatic diseases // Curr. Opin. Rheumatol. - 2007. - V. 19. - № 2. - P. 163-167.
3. Asilian A., Faghihi G., Momeni A., Radan M.R., Meghdadi M., Shariati F. Leprosy profile in Isfahan (A province of Iran) // Int. J. Lepr. Other. Mycobact. Dis. - 2005. - V. 73. - № 2. - Р. 129-130.
4. Bartos F. The function of the cytocentrum in amitosis // Biologia (Bratisl). - 1965. - V. 20. - № 11. - P. 873-876.
5. Basta P.C., Coimbra C.E., Camacho L.A., Santos R.V. Risk of tuberculous infection in an indigenous population from Amazonia, Brazil // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. - 2006. - V. 10. - № 12. - Р. 1354-1359.
6. Bhutto A.M., Solangi A., Khaskhely N.M., Arakaki H., Nonaka S. Clinical and epidemiological observations of cutaneous tuberculosis in Larkana, Pakistan // Int. J. Dermatol. - 2002. - V. 41. - № 3. - P. 159-165.
7. Boll I.T. Origin of the early megakaryopoietic progenitor cell and further polyploidization in the thrombopoietic cell series. Phase-contrast observations of human bone marrow // Acta. Haematol. - 1981. - V. 66. - № 3. - P. 187-194.
8. Braxs A., Braxs J. Morphological studies of amitosis in tumor cells in pleural fluid and in cells from curettage of the conjunctiva // Rev. Fac. Cienc. Med. Cordoba. - 1966. - V. 24. - № 2. - P. 143-146.
9. Chen Y.Q., Wan B.K. A study on amitosis of the nucleus of the mammalian cell. I. A study under the light and transmission electron microscope // Acta. Anat. (Basel). - 1986. - V. 127. - № 1. - P. 69-76.
10. Ciatto S. Current cancer profiles of the Italian regions: should cancer incidence be monitored at a national level? // Tumori. - 2007. - V. 93. - № 6. - P. 529-531.
11. Cotte C., Easty G.C., Neville A.M., Monaghan P. Preparation of highly purified cytotrophoblast from human placenta with subsequent modulation to form syncytiotrophoblast in monolayer cultures // In Vitro. - 1980. - V. 16. - № 8. - P. 639-646.
12. David H., Uerlings I. Ultrastructure of amitosis and mitosis of the liver // Zentralbl. Pathol. - 1992. - V. 138. - № 4. - P. 278-283.
13. Elias H., Fong B.B. Nuclear fragmentation in colon carcinoma cells // Hum. Pathol. - 1978. - V. 9. - № 6. - P. 679-684.
14. Elias H., Hyde D.M. Separation and spread of nuclear fragments ("nucleotesimals") in colonic neoplasms // Hum. Pathol. - 1982. - V. 13. - № 7. - P. 635-639.
15. Ferguson F.G., Palm J. Histologic characteristics of cells cultured from rat placental tissue // Am. J. Obstet. Gynecol. - 1976. - V. 124. - № 4. - P. 415-420.
16. Forest M. Anatomopathological aspects of giant cell tumors of the bone // Rev. Chir. Orthop. Reparatrice. Appar. Mot. - 1975. - V. 61. - № 5. - P. 359-375.
17. Gotzos V. In vitro culture of human peritoneal fluid cells // Acta. Anat. (Basel). - 1977. - V. 98. - № 3. - P. 281-294.
18. Jurkiewicz D., Wojdas A., Hermanowski M. Malignant tumors of the nose and paranasal sinuses in the years 1971-2005 in the material of the Otolaryngology Clinic WIM // Otolaryngol. Pol. - 2007. - V. 61. - № 4. - P. 572-575.
19. Kriesten K. Relative incidence of mitosis and binucleated cells, nuclear volume and nucleolar rate per nucleus in the mammary gland eipithelium of the mouse during differentiation in the gestational and lactation phase // Gegenbaurs. Morphol. Jahrb. - 1984. - V. 130. - № 2. - P. 307-314.
20. Kuhn E.M., Therman E., Susman B. Amitosis and endocycles in early cultured mouse trophoblast // Placenta. - 1991. - V. 12. - № 3. - P. 251-261.
21. Murch A.R., Grounds M.D., Marshall C.A., Papadimitriou JM. Direct evidence that inflammatory multinucleate giant cells form by fusion // J. Pathol. - 1982. - V. 137. - № 3. - P. 177-180.
22. Neftel K.A., Muller O.M. Heat-induced radial segmentation of leucocyte nuclei: a non-specific phenomenon accompanying inflammatory and necrotizing diseases // Br. J. Haematol. - 1981. - V. 48. - № 3. - P. 377-382.
23. Ngoan le T., Lua N.T., Hang L.T. Cancer mortality pattern in viet nam. // Asian Pac. J. Cancer Prev. - 2007. - V. 8. - №  4. - P. 535-538.
24. Ohse H., Ishii Y., Saito T., Watanabe S., Fukai S., Yanai N., Tamai N., Monma Y.,   Hasegawa S. A case of pulmonary tuberculosis associated with tuberculous fistula of anus // Kekkaku. - 1995. - V. 70. - № 6. - P. 385-388.
25. Paoli J., Smedh M., Wennberg A.M., Ericson M.B. Multiphoton laser scanning microscopy on non-melanoma skin cancer: morphologic features for future non-invasive diagnostics // J. Invest Dermatol. - 2008. - V.128. - № 5. - P. 1248-1255.
26. Tang N., Li C., Xu J. Experimental study on regenerative capacity and form of corneal endothelial cells in the primate // Zhonghua Yan Ke Za Zhi. - 1998. - V. 34. - № 1. - P. 28-30.
27. Tashiro T., Kawakita C., Takai C., Yoshida T., Sakiyama S., Kondo K., Sano N. Primary pulmonary malignant peripheral nerve sheath tumor: a case report // Acta. Cytol. - 2007. - V. 51. - № 5. - P. 820-824.
28. Walen K.H. Spontaneous cell transformation: karyoplasts derived from multinucleated cells produce new cell growth in senescent human epithelial cell cultures // In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. - 2004. - V. 40. - № 5-6. - P. 150-158.
29. Walen K.H. Budded karyoplasts from multinucleated fibroblast cells contain centrosomes and change their morphology to mitotic cells // Cell. Biol. Int. - 2005. - V. 29. - № 12. - P. 1057-1065.
30. Yang H., Zhang L., Zhao X.K. The growth and morphological characteristics of human and rabbit corneal endothelium in tissue culture // J. Tongji. Med. Univ. - 1991. - V. 11. - № 2. - P. 116-122.
31. Yun C., Cho H., Kim S.J., Lee J.H., Park S.Y., Chan G.K., Cho H. Mitotic aberration coupled with centrosome amplification is induced by hepatitis B virus X oncoprotein via the Ras-mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase-mitogen-activated protein pathway // Mol. Cancer Res. - 2004. - V. 2. - № 3. - P. 159-169.
32. Zhu J., Beattie E.C., Yang Y., Wang H.J., Seo J.Y., Yang L.X. Centrosome impairments and consequent cytokinesis defects are possible mechanisms of taxane drugs // Anticancer Res. - 2005. - V. 25. - № 3B. - P. 1919-1925.