НИИ медицинской генетики СО РАМН, г. Томск
Лаборатория цитогенетики
Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 70-й Юбилейной итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 16-18 мая 2011 г.), под ред. В. В. Новицкого, Л. М. Огородовой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2011. − 430 с.
Актуальность: в последние годы интенсивно накапливаются данные, свидетельствующие о значительной роли не только генетических, но и эпигенетических процессов в регуляции раннего эмбрионального развития человека. Основой эпигенетических феноменов является метилирование ДНК - наследуемые изменения функций гена, не связанные с нарушениями его первичной нуклеотидной последовательности. Ранние этапы онтогенеза характеризуются высокой частотой хромосомного мозаицизма, который является результатом митотической нестабильности, а также эпигенетическим репрограммированием генома, в ходе которого происходит стирание метилирования и последующее его установление de novo. Учитывая интенсивность этих процессов, можно ожидать возникновение ошибок репрограммирования на ранних этапах развития, вероятность которых может быть на один-два порядка выше, по сравнению с мутациями, возникающими в ходе репликации ДНК. Вполне вероятно, что аберрантное метилирование генов контроля клеточного цикла, вызвавшее его инактивацию, может привести к нарушению работы соответствующей сверочной точки и возникновению клеток с числовыми хромосомными нарушениями. В результате предыдущих исследований статуса метилирования некоторых генов контроля клеточного цикла было показано высокая частота эпимутуций генов RB1 и P14ARF у спонтанных эмбрионов с мозаичными формами числовых хромосомных аномалий [1, 2]. В настоящее время проводятся дальнейшие исследования, в результате которых будет пополняться список кандидатных генов, эпимутации в которых могут инициировать митотическую нестабильность в эмбриогенезе.
Цель: установить вклад эпимутаций гена контроля клеточного цикла P16/CDKN2A в возникновение митотической нестабильности в эмбриогенезе человека.
Материалы и методы: исследование статуса метилирования гена P16/CDKN2A проведено во внезародышевых тканях 33 спонтанных абортусов первого триместра беременности с мозаичными формами анеуплоидий. В качестве контрольной группы были изучены те же внезародышевые ткани 20 индуцированных абортусов первого триместра беременности, полученных от здоровых женщин, не пожелавших сохранить нормально протекавшую беременность по социальным показаниям. Анализ статуса метилирования генов проводили в образцах геномной ДНК, выделенных из некультивированных тканей цитотрофобласта хориона (ЦХ) и экстраэмбриональной мезодермы (ЭМ), как производных зародышевых листков, отличающихся по характеру эпигенетического репрограммирования генома на ранних этапах эмбриогенеза [1]. Выделение ДНК проводили по стандартной методике с использованием протеиназы К с последующей экстракцией фенол/хлороформом. Далее проводили метил-чувствительную ПЦР. Для этого перед амплификацией ДНК подвергали гидролизу с использованием метилчувствительной рестриктазы HpaII. После амплификации фрагменты ДНК фракционировали в 2%-ном агарозном геле и визуализировали в проходящем УФ свете на установке GelDoc («Bio-Rad»,США). Структура обследованных выборок приведена в таблице.
|
Таблица 1.
Структура и объем исследованных выборок.
|
| группа эмбрионов |
число обследованных эмбрионов |
| ЭМ |
ЦХ |
обе ткани |
| спонтанные абортусы (n=33) |
20 |
22 |
9 |
| медицинские абортусы (n=20) |
20 |
20 |
20 |
Результаты: исследование статуса метилирования гена в контрольной группе показало, что во внезародышевых тканях индуцированных абортусов промоторный регион гена Р16/CDKN2A не метилирован. Анализ статуса метилирования гена у спонтанных абортусов с мозаичными формами анеуплоидий показал, что в ЦХ аберрантное метилирование встречается в 6 из 22 случаев (27%), а в ЭМ в 5 из 20 (25%). В трех из девяти случаях, когда у одного и того же эмбриона были исследованы обе внезародышевые ткани, эпимутации в промоторе гена были выявлены либо в ЦХ, либо в ЭМ. Таким образом, выявленные нарушения статуса метилирования гена затрагивают только одну ткань. Данные результаты позволяют предположить, что эпимутации гена Р16/CDKN2A возникли уже после обособления зародышевых листков, во время установления тканеспецифичного метилирования. Ген Р16/CDKN2A расположен в локусе INK4a/ARF, регионе в 9p21, здесь же локализован ген P14ARF. Оба гена имеют общие второй и третий экзоны, тогда как промоторные регионы у них разные. Можно предположить, что нарушения метилирования CpG-сайтов затронут весь регион. Действительно, в предыдущих исследованиях в нашей лаборатории было показано, что эпимутации в промоторной области гена P14ARF выявляются во внезародышевых тканях абортусов с мозаичными трисомиями с частотой 9%, причем также, только в одной из исследованных тканей. Для того, чтобы выяснить как соотносится метилирование промоторов этих генов у спонтанных абортусов необходимо расширение выборки для анализа гена Р16/CDKN2A и включение в нее эмбрионов с эпимутацией гена P14ARF.
Выводы: при ранней эмбриональной гибели у человека наблюдается аберрантное метилирование промоторной области гена Р16/CDKN2A с частотой 27% в ЦХ и 25% в ЭМ. Эпимутации произошли уже после разделения зародышевых листков.
Список литературы:
1. Эпигенетическая инактивация гена RB1 как фактор нестабильности генома: возможный вклад в этиологию хромосомного мозаицизма в эмбриональном периоде развития человека / Е. Н. Толмачева, А. А. Кашеварова, И. Н. Лебедев и др. // Мол. ген. – 2008. – № 11. – С. 1461-1467.
2. Сравнительный анализ аномального метилирования CpG-островков, расположенных в промоторных областях генов Р16/CDKN2A и P14ARF, при немелкоклеточном раке легкого и остром лимфобластном лейкозе / В.В. Землякова, В.В. Стрельников и др. // Мол. биол. – 2004. - № 6. – С. 966-972.
|
