Эта статья опубликована в сборнике статей по материалам XII Российского конгресса молодых  ученых  с  международным  участием "Науки о человеке"  (Томск, 26-27 мая 2011 г.) / под ред.   Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2011. – 104 с. 

Скачать сборник целиком (PDF, 1,6 MB)

Введение. Программированная клеточная гибель имеет большое значение в поддержании го- меостаза иммунной системы. Нарушение работы механизмов регуляции апоптоза лежит в основе развития многих заболеваний [1]. В связи с этим, для разработки новых терапевтических подходов, представляет интерес изучение механизмов модуляции апоптоза. Одним из апоптозрегулирующих факторов является белок теплового шока 90 (HSP90), увеличение содержания которого наблюдается во многих опухолевых клетках [2].

Цель. Изучить факторы, модулирующие апоптоз Т-лимфоцитов здоровых доноров и клеток линии Jurkat.

Материал и методы. Мононуклеарные лейкоциты здоровых доноров и клетки Т- лимфобластной лейкемии человека линии Jurkat (институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) культивировали суспензионным методом с добавлением в среду 30 нг/мл рекомбинантного TNFα и 5мкМ ингибитора HSP90 17-AAG. Через 18 часов инкубации оценивали содержание апоптотически измененных клеток по связыванию аннексина-V, меченного FITC, и пропидий йодида на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss («Abcam», UK). Изменение трансмембранного потенциала митохондрий исследовали через 18 часов с помощью набора реагентов BD Biosciences (США) на проточном цитометре (BD FACSCalibur Flow Cytometer, США). Активность каспазы-8 и -3 определяли фотоколориметрическим методом через 2 и 3 часа инкубации, соответственно. Контрольную группу составили интактные клетки.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни с учетом поправки Бонферрони.

Результаты и обсуждение. В клетках линии Jurkat при добавлении r-TNFα и 17-AAG отмечался достоверно более высокий уровень апоптоза, по сравнению с остальными условиями культивирования (р<0,05). Так содержание апоптотически измененных клеток при совместном действии r-TNFa и ингибитора HSP90 составило 88,68 (67,79-93,85)%, что было в 18 раз выше аналогичного показателя, полученного при исследовании интактных клеток, и в 3,5 раза выше, чем при действии rTNF-α или 17-AAG. Полученные результаты, возможно, связаны с тем, что HSP90 стабилизирует транскрипционные факторы RIP, Akt и NF-KB, активируемые сигналами от TNFα и приводящие к повышению жизнеспособности клеток [2].

При определении количества мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров в состоянии апоптоза, достоверных различий между группами с добавлением r-TNFα и 17-AAG или одного из препаратов выявлено не было (р>0,05). Отсутствие цитотоксического эффекта 17-AAG на мононук- леарные лейкоциты здоровых доноров, может говорить о том, что HSP90 в нормальных клетках не обладает значительным апоптозрегулирующим действием, как в опухолевых. Разный апоптогенный эффект ингибитора HSP90 в исследованных клетках, вероятно, связан с особенностями строения и внутриклеточного содержания данного белка. Например, известно, что в трансфор-мированных клетках HSP90 находится в мультишаперонном комплексе с высокой АТФ-азной активностью, который не характерен для нормальных клеток.

Ингибирование HSP90 в опухолевых клетках с помощью 17-AAG приводило к статистически значимому увеличению активности каспазы-8 (р<0,05). Исходя из этого, можно предположить, что белок теплового шока HSP90 влияет на активацию инициаторной каспазы-8. Так как активность каспазы-8 при совместном действии на клетки r-TNFa и 17-AAG достоверно не отличалась от изучаемого параметра при добавлении одного из препаратов, можно предположить, что HSP90 напрямую ин- гибирует превращение прокаспазы-8 в активную форму.

Активности каспазы-3 в клетках линии Jurkat достоверно увеличивалась при добавлении 17- AAG (р<0,05). Причем активность каспазы-3 увеличивалась в большей степени при ингибировании HSP90 без индуктора апоптоза, чем при совместном действии r-TNFα и 17-AAG. Это может быть связано с неоднозначной ролью TNFα в запуске программированной клеточной гибели [3].

Количество клеток линии Jurkat с деполяризованной митохондриальной мембраной было достоверно выше как при совместном действии 17-AAG и r-TNFα, так и при добавлении одного из препаратов, по сравнению с интактными клетками (р<0,05). Следовательно, белок теплового шока HSP90 может влиять на целостность мембраны митохондрий.

Заключение. В результате исследования было выявлено, что белок теплового шока 90 принимает участие в регуляции апотоза опухолевых клеток. Ингибирование HSP90 увеличивает чувствительность клеток линии Jurkat к апоптозу, индуцированному TNF-α, приводит к активации каспазы-8 и -3 и деполяризации митохондриальной мембраны. На мононуклеарные клетки здоровых доноров ингибитор 17-AAG не оказывает проапоптотического эффекта.