|
НИИ биохимии СО РАМН (г. Новосибирск)
Эта работа опубликована в сборнике "Науки о человеке": материалы VI конгресса молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2005. – 120 с.
Скачать сборник целиком
Активация биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей при участии резидентных макрофагов, липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и глюкокортикоидов в ответ на функциональное напряжение организма была открыта в НИИ биохимии СО РАМН Паниным Л. Е. [1]. Один из глюкокортикоидов, кортизол, хорошо известен как гормон стресса и известны механизмы гормональной индукции с его участием. Однако механизмы нового явления принципиально отличаются от глюкокортикоидной индукции. Было показано, что основными компонентами при таком стимулировании экспрессии генов являются аполипопротеин А-I (апоА-I) - белок ЛПВП и восстановленные в макрофагах формы стероидных гормонов, например, тетрагидрокортизол (ТГК). В присутствии комплексов некоторых стероидных гормонов с апоА-I происходил активный синтез ДНК в гепатоцитах, связанный с их пролиферацией. В этих условиях значительно стимулировалось включение 3Н-тимидина в ДНК [2, 3].
Материал и методы. В нашей работе способность комплекса апоА-ЬТГК инициировать копирование изолированной ДНК крыс Вис-тар исследовали с помощью фрагмента Кленова [4]. (Sigma, США) - функциональной части ДНК-зависимой ДНК-полимеразы I E. coli и белкового ядерного экстракта из клеток печени крыс Вистар, содержащего все полимеразы. Для обнаружения новосинтезированных ДНК в процессе копирования использовали меченные а[32Р]-трифосфаты дезоксирибонуклеотидов (НИХБиФМ, Новосибирск). ДНК, белковый ядерный экстракт и апоА-I выделяли из печени и крови крыс, а также характеризовали как описано ранее [4, 5]. Одноцепочечные олиго-нуклеотиды CC(GCC)5 (Г1), и комплементарный ему GG(CGG)5 (Г2) синтезированы в НИХБиФМ (Новосибирск). Для обнаружения после электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) на 5*-конец олигонуклеотидов вводили метку стандартным методом. Дуплекс Г1хГ2 получали отжигом [4].
Результаты и обсуждение. Показано, что при мольном соотношении ДНК - комплекс апоА-Ьстероид (ТГК, андростерон - АС), равном 1:50, синтезируется на 20 % больше копий ДНК, чем в отсутствие комплекса. К подобному результату приводят как фрагмент Кленова, так и полимеразы из ядерного экстракта клеток крыс. При дальнейшем повышении концентрации комплекса апоА-Ьстероид наблюдали ингибирова-ние реакции копирования до практически полного ее отсутствия. Это можно объяснить связыванием избытка комплекса апоА-Ьстероид с теми последовательностями ДНК, на которых осуществлялось копирование, и неспособностью ДНК-полимеразы конкурировать за эти участки, что подтверждает ранее полученные данные. Поскольку ранее было показано, что комплексы апоА-I-стероид (ТГК, АС, дегидроэпиандростерон - ДЭАС и дегидроэпиандростерон-сульфат - ДЭАСС) способны влиять на вторичную структуру ДНК, вызывая появление однонитевых последовательностей в сайтах связывания [4], можно утверждать, что в этих участках инициируется копирование ДНК. 
Показано, что в присутствии даже небольшого избытка комплекса апоА-I-ТГК одноцепочечные олигонуклеотиды CC(GCC)5 (Г1), и GG(CGG)5 (Г2), имитирующие сайты связывания комплекса на ДНК, защищаются от действия нуклеазы S1 (рис.), которая расщепляет их количественно в отсутствие комплекса.
Радиоавтограф электрофореграммы 20% нативного ПААГ Дуплекс Г1 х Г2: дорожки 1-4; олигонуклеотид Г1: дорожки 5-8; олигонуклеотид Г2: дорожки 9-12; обработаны нуклеазой S1: дорожки 2-4, 6-8, 10-12; в присутствии комплекса апоА-I-ТГК: дорожки 3, 4, 7, 8, 11, 12
Заключение. Таким образом, появление дополнительных однонитевых участков в сайтах связывания комплекса апоА-I-стероид с ДНК активирует копирование изолированной ДНК и способно на наш взгляд служить инициатором процесса репликации in vivo и, тем самым, пролиферации гепатоцитов.
Литература:
1. Панин Л. Е., Усынин И. Ф., Харьковский А. В. Диплом № 99 Международной Ассоциации авторов открытий. 1998 г. Панин Л. Е. Роль аполипопротеина А-I в активации биосинтеза белка и ДНК в гепатоцитах под влиянием стероидных гормонов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - Т. 131. - N. 1. - С. 63-65.
2. Panin L. E. Activation of nucleolar DNA expression in hepatocytes by glucocorticoids and high density lipoproteins // J. of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. - 2002. - V. 81. - P. 69-76.
3. Гимаутдинова О. И. Специфические изменения вторичной структуры ДНК эукариот под влиянием комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I // Молекулярная биология. - 2002. - Т. 36. - С. 103-105.
4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир. - 1984. - С. 146-272.
|
