|
ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (г. Томск); Отдел структурной макрокинетики ТНЦ СО РАН (г. Томск)
Эта работа опубликована в сборнике "Науки о человеке": материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М.
Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2008. – 135 с.
Посмотреть обложку сборника
Скачать сборник целиком
В настоящее время достигнуты определенные успехи в создании конструкций, включающих неорганические наночастицы и нуклеиновые кислоты для решения актуальных задач современной медицины: диагностики (выделение нуклеиновых кислот, биосенсоры, ДНК-чипы) и терапии (целевая доставка, генотерапия). Разработка бионанокомпозитов на основе оксидных ферримагнетиков открывает перспективу управления созданными конструкциями in vitro и in vivo посредствам наложения внешнего магнитного поля. С другой стороны, закрепление ДНК на поверхности частицы позволяет повысить стабильность биомолекулы, например, препятствовать ее нуклеазной деградации [1].
Целью данной работы было исследовать устойчивость молекул ДНК в составе бионано-композитного комплекса на основе частиц нанопорошка CoFe2O4 к ферментативному расщеплению.
Материалы и методы. Суперпарамагнитный нанопорошок кобальтового феррита CoFe2O4 был получен методом механохимического синтеза на базе Отдела структурной макрокинетики ТНЦ СО РАН. Суспензию частиц нанопорошка (0,5 мг/мл) получали методом ультразвуковой дезинтеграции (Microson XL2005) в буфере 10 мМ Tris-HCl (рН=8.6). Концентрацию атомов железа в суспензии определяли методом рентгенофлуоресцентного анализа (Quant'X). В работе использовали фрагментированную ультразвуком геномную ДНК лосося (Медиген). Концентрацию ДНК в растворе определяли спектрофотометрическим методом по поглощению при длине волны 260 нм (Юнико 2800). Формирование бионанокомпо-зитного комплекса проводили в 10 мМ Tris-HCl буфере при изменении рН среды. Комплекс отделяли из раствора методом магнитной сепарации. Адсорбционную емкость (А) частиц CoFe2O4 относительно ДНК рассчитывали по формуле:
A = (Ci-Co)• V/m (1),
где Сi - исходная концентрация ДНК в растворе, мг/мл;
Со - концентрация не связавшейся ДНК в супернатанте, мг/мл;
V - объем реакционной среды, мл;
m - масса нанопорошка, мг.
Ферментативное расщепление эндонуклеазой DNase I (Promega) проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 40мМ Tris (pH=8.0), 1mM CaCl2, 10mM MgSO4, 2 U фермента, 2 и 10 мкг ДНК/ДНК-CoFe2O4 при 370С, в течении часа. Электрофоретический анализ проводили в 1,5% агарозном геле (Трис-ацетатный буфер, рН=8.0).
Результаты и их обсуждение. В результате проведенных исследований установлено, что эффективное связывание ДНК (96,27±0,19%) с частицами CoFe2O4 осуществлялось при кислом значении рН среды (<4.0). Адсорбционная емкость частиц нанопорошка феррита кобальта относительно ДНК составила 0,2. Формирующийся комплекс проявлял более низкую электрофоретическую подвижность, что, вероятно, обусловлено увеличением размеров ДНК при связывании с частицами CoFe2O4. После обработки DNase I не связанная ДНК (в контроле и в суспензии с наночастицами при щелочном значении рН=8.6) полностью расщеплялась ферментом, тогда как ДНК, входящая в состав комплекса с частицами CoFe2O4 была устойчива к действию нуклеазы (Рис. 1).
 Рисунок 1. Электрофореграмма
1- маркер 100 bр; 2- ДНК-CoFe2O4 (10 мкг); 3- CoFe2O4 (10 мкг)+ DNase I; 4-ДНК-CoFe2O4 (2 мкг) + DNase I; 5- суспензия ДНК (1 мкг) и частиц CoFe2O4 (рН=8.6); 6 -суспензия ДНК и частиц + DNase I; 7 - контрольная ДНК (10 мкг); 8 - контрольная ДНК (10 мкг) + DNase I.
Таким образом, частицы феррита кобальта не оказывают ингибирующего эффекта на активность DNase I. Механизм формирования комплекса ДНК-CoFe2O4, вероятно, обусловлен изменениями как молекулы ДНК, так и частиц нанопорошка. При снижении рН среды <4.0 происходит дестабилизация структуры ДНК, с другой стороны поверхность частиц дегид-роксилируется, что приводит к образованию Льюисовских кислотных центров. Атомы Fe и Со, обладающие незаполненной d-орбиталью, могут взаимодействовать с атомами ДНК, имеющими неподеленную электронную пару: оснований (N7 и O6 гуанина, N7 и N1 аденина, и N3 пиримидинов) и фосфатной группы с образованием координационных связей [2]. Протекционное действие может быть обусловлено конформационными изменениями биомолекулы при формировании комплекса, а так же снижением стерической доступности CoFe2O4-связанной ДНК для фермента [3].
Заключение. Показана принципиальная возможность создания бионанокомпозитного комплекса ДНК-CoFe2O4, обладающего магнитными свойствами и проявляющего устойчивость к нуклеазному расщеплению. Дальнейшее исследования свойств и параметров стабильности полученного комплекса позволят определить область его биомедицинского приложения.
Работа поддержана грантами РФФИ (06-04-96962-р_офи) и (07-04-12170-офи)
Список литературы:
1. Roy I., Ohulchanskyy T.Y., Bharali D.J. et al. Optical tracking of organically modified silica nanoparticles as DNA carriers: A nonviral, nanomedicine approach for gene deliv-ery//Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2005. V.102(2). - P. 279-284.
2. Anastassopoulou J. Metal-DNA interactions //J. of Molecular Structure, 2003. V.651-653. P. 19-26.
3. He X.X., Wang K., Tan W. et al. Bioconjugated nanoparticles for DNA protection from cleavage// J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P.7168-1769.
|
