Научный руководитель: канд. биол. наук Е.Н. Воронина

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Эта работа была опубликована в cборнике материалов I Всероссийской научной студенческой конференции с международным участием «МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ: ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ», под редакцией проф., д-ра мед. наук С.И. Карася (г. Томск, 10-11 ноября 2011 года). 

Введение. Варфарин - клинически эффективный, широко применяемый оральный антикоагулянт для лечения и предотвращения тромбозов различной этиологии. Молекулярной мишенью варфарина является фермент - витамин К-эпоксидредуктаза (VKOR). Роль этого фермента в каскаде свертывания крови - восстановление окисленного витамина К, необходимого для карбоксилирования четырех факторов свертывания (II, VII, IX и X). Варфарин ингибирует восстановление витамина К и тем самым блокирует каскад свертывания крови. Этот препарат имеет узкий терапевтический индекс и широкую межиндивидуальную изменчивость в дозах препарата для достижения целевого лечебного эффекта [1].
Большое количество исследований направлено на определение вклада различных факторов, опосредующих реакцию пациентов при приеме варфарина. На сегодняшний день описано несколько генетических маркеров, ассоциированных с вариабельностью дозы варфарина, среди которых наибольший вклад (20-30%) вносят полиморфные варианты гена VKORC1. На дозу варфарина также влияет активность его метаболизма ферментом CYP2C9 (до 15% изменчивости). Несколько полиморфных вариантов гена CYP2C9 идентифицированы как уменьшающие активность фермента, что приводит к увеличению концентрации варфарина в плазме крове и развитию геморрагий различной степени тяжести. Помимо этих двух генов рассматриваются и другие гены, кодирующие белки, участвующие в реализации действия варфарина - GGCX (гамма-глутимил карбоксилаза), PROC (белок C), FVII (Vl^ фактор свертывания крови), CYP4F2 (цитохром 4F2). В различных исследованиях было показано, что 2-3% изменчивости в дозе может объясняться наличием полиморфных замен в гене GGCX, 7-9% - в гене PROC, 4% - в гене CYP4F2, 1% - в гене FVII [1,2,3]. Среди негенетических предикторов значимый вклад в межиндивидуальную изменчивость дозы был показан для возраста - около 7-9%, пола - до 2% и массы тела - примерно 6% [1,4]. Изученные частоты встречаемости этих вариантов, а также степень их влияния на индивидуальную дозу варфарина среди представителей различных рас и популяций существенно различаются. Таким образом, большой интерес для применения варфарина в лечебной практике представляет исследование факторов, влияющих на индивидуальную дозу варфарина для регионов и популяций России.

Цель работы. Целью нашей работы было исследование влияния полиморфных вариантов генов VKORC1 (1173 C>T, rs9934438), CYP2C9 (*2, *3), GGCX (12970 C>G, rs11676382), PROC (2583 A>T, rs1799810), FVII (10976 G>A, rs6046), CYP4F2 (23454 G>A (V433M), rs2108622) и негенетических параметров на вариабельность дозы варфарина среди жителей Западно-Сибирского региона России.

Материал и методы. В группу пациентов, принимающих варфарин (95 человек), вошли больные, проходившие лечение в Центре Новых Медицинских Технологий в г. Новосибирске. У всех пациентов на протяжении периода лечения измерялось международное нормализованное отношение. В группе из 95 человек было 36% женщин, 64% мужчин; возраст больных составлял от 16 до 76 лет, в среднем - 52,9 лет. Подбор дозы для достижения целевых значений МНО осуществлялся эмпирическим путем.
ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол-хлороформом и осаждение ДНК этанолом.
Определение генотипов полиморфных локусов проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan зондов, комплементарных полиморфной последовательности ДНК.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica for Windows, v.8 (StatSoft, Inc.). Тест на соблюдение равновесия Харди-Вайнберга проводили с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия; http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1.pl)

Результаты и обсуждение. Полученные в нашей выборке частоты аллелей соответствовали распределению Харди-Вайнберга. Доза вар-фарина значимо различалась среди носителей разных генотипов по полиморфным вариантам генов VKORC1 (1173 C>T) и CYP2C9 (аллель *3 - 42614 A>C) (p=0,0000 и p=0,018 соответственно). Для носителей генотипа C/C полиморфного локуса 1173 C>T гена VKORC1 (N=41) средняя доза составляла 6,25 мг/день, C/T (N=44) - 5,0 мг/день, T/T (N=8) - 2,81 мг/день. Для носителей генотипа A/A полиморфного локуса 42614 A>C (*3) гена CYP2C9 (N=86) - 5,0 мг/день, A/C - 3,1 мг/день. Для этих полиморфных вариантов проводился линейный регрессионный анализ, где зависимым признаком выступала доза варфарина, а предиктором - генотип. Полученные в результате анализа коэффициенты детерминации говорили о том, что полиморфный вариант 1173 C>T гена VKORC1 объясняет 19,51% межиндивидуальной изменчивости в дозе препарата; а аллель*3 гена CYP2C9 - 3,6% (p=0,000006 и 0,036276 соответственно). Для остальных исследуемых полиморфных вариантов не было выявлено значимых ассоциаций с дозой варфарина (CYP2C9*2 (р=0,5204), GGCX 12970 C>G (р=0,2919), PROC 2583 A>T (р=0,6613), FVII 10976 G>A (р=0,4724), CYP4F2 23454 G>A (р=0,0697))
Затем в различные множественные регрессионные модели для оценки совместного влияния признаков поочередно включали значимые генетические предикторы, а также возраст и пол пациентов. По отдельности возраст и пол не достигали статистической значимости в качестве предикторов дозы, но при добавлении данных о поле в модель с VKORC1 1173 C>T, CYP2C9*3 наблюдалось наибольшее значение коэффициента детерминации - 19,58 % при p-value модели <0,00005.

Выводы.
1.    Среди исследованных полиморфных вариантов генов в нашей выборке значимое влияние на дозу варфарина имели VKORC1 1173 C>T и CYP2C9*3.
2.    Одномерный регрессионный анализ показал, что VKORC1 1173 C>T вносит 19,51%, а CYP2C9*3 - 3,6% изменчивости в дозе варфарина в нашей выборке. Полученная множественная регрессионная модель, включающая в себя VKORC1 1173 C>T, CYP2C9*3 и данные о поле пациентов, объясняла 19,58% изменчивости в дозе варфарина.

Список литературы:
1.    Mia Wadelius, Leslie Y. Assocition of warfarin dose with genes involved in its action and metabolism.// Hum Genet (2007); Vol. 121, pp. 23-34.
2.    Cen HJ, Zeng WT. CYP4F2 rs2108622: a minor significant genetic factor of warfarin dose in Han Chinese patients with mechanical heart valve replacement.// Br J Clin Pharmacol. (2010) Aug; 70(2), pp. 234-40.
3.    Aquilante CL, Langaee TY. Influence of coagulation factor, vitamin K epoxide reductase complex subunit 1, and cytochrome P450 2C9 gene polymorphisms on warfarin dose requirements.// Clin Pharmacol Ther. (2006) Apr; 79(4), pp. 291-302.
4.    Mia Wadelius, Ly Chen et al. Common VKORC1 and GGCX polymorphisms associated with warfarin dose. // The Pharmacogenomics Journal (2005); Vol. 5, pp. 262270.