Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 70-й Юбилейной итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 16-18 мая 2011 г.), под ред. В. В. Новицкого, Л. М. Огородовой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2011. − 430 с.

 

Скачать сборник (формат MS Word, 7,3 мб)

Посмотреть основную информацию о сборнике, обложку и т.д.

 

Актуальность: в России опухоли желудка находятся на втором месте по заболеваемости среди других новообразований, уступая раку легкого у мужчин и раку молочной железы у женщин. Существует множество форм новообразований желудка, точный диагноз определяется гистологической структурой опухоли [1]. Оценка пролиферативной активности раковых клеток необходима для определения стратегии лечения и прогноза заболевания.

Цель: разработать метод количественной иммуногистохимической оценки экспрессии белков-маркеров пролиферации (Кi-67) и апоптоза (P53) при различных морфологических типах злокачественных новообразованиях желудка, используя технологии ImageJ.

Задачи:

1. Проведение иммуногистохимического исследования и создание коллекции изображений.
2. Разработка и тестирование алгоритмов и методов количественной оценки иммуногистохимических показателей.
3. Разработка модуля программы ImageJ для проведения количественного иммуногистохимического исследования.
4. Проведение исследования экспрессии маркеров апоптоза и пролиферации при новообразованиях желудка на основе разработанного метода количественной иммуногистохимической оценки.

Материалы и методы: для иммуногистохимических исследований использовали биопсии желудков, полученные при гастроэктомии у людей с диагнозом: рак тела желудка, 3стадия, Т3N1M0. Пациенты находились на лечении в НИИ Гастроэнтерологии СибГМУ (г. Северск).

Фиксацию материала проводили в забуференном формалине, промывали в водопроводной воде и обезвоживали в изопропиловом спирте. После чего материал заливали в парафин и готовили срезы толщиной 5 мкм. Гистохимическое окрашивание осуществляли по стандартной методике с использованием моноклональных антител к Кi-67 и Р53, согласно прилагаемого протокола. Гистологическое исследование и фотосъемку микропрепаратов проводили на микроскопе AxioScope 40 (Zeiss, Германия). Анализ изображений и разработка модуля осуществляли с помощью общедоступной программы ImageJ, основанной на Java.

Определяли площадь, занимаемую иммунопозитивными структурами, их количество. Относительная площадь экспрессии (S, %) рассчитывалась по следующим формулам [2]:
S=S_{иммунопозитивных структур}/S _{структур} *100,
S=S_{иммунопозитивных ядер в железах}/S_ядер*100,
S=S_{иммунопозитивных структур}/S_ткани*100.

Результаты: получили оцифрованную коллекцию иммуногистохимических изображений препаратов с маркерами апоптоза (Р53) и пролиферации (Кi-67) в формате *.jpg. На основе данной коллекции проводили измерения изучаемых показателей. На изображениях ядра клеток (фиолетовые) и иммунопозитивные структуры (коричневые) находятся в смежных цветовых каналах, что затрудняет анализ изображения. Для преодоления описанного эффекта проводили разделение на три цветовых канала: зеленый, синий, красный. При этом наиболее контрастные иммунопозитивные структуры наблюдались в синем канале. При создании бинарного изображения канала получали выделенными только иммунопозитивные структуры. В случае наличия ядерного маркера проводили разбиение на клетки.

Выводы: разработаны параметры для количественной оценки иммуногистохимических исследований, на основании которых реализован алгоритм в виде действующего плагина в программе ImageJ, позволяющий проводить количественное исследование иммуногистохимических реакций.