Известно, что десять акроцентрических хромосом человека (акроцентрики D- и G-групп) формируют ядрышко после выхода клетки из митоза. При этом нуклеогенез по существу определяется транскрипционной активностью рибосомных генов, локализованных в спутничных нитях или в ядрышкообразующих районах (ЯОР) акроцентриков. Активные ЯОР могут быть выявлены при световой микроскопии препаратов интерфазных клеток после обработки раствором нитрата серебра. В основе реакции лежит специфическое связывание ионов металла с нуклеолярными кислыми негистоновыми белками, по-видимому, принимающими участие в транскрипции и процессинге прерибосомной РНК. Таким образом, размер, форма и число ядрышек являются важнейшими показателями уровня дифференцировки и функционального состояния клетки. В последние годы, в связи с появлением новых компьютерных технологий,  возрос интерес к изучению субпопуляционной и функциональной гетерогенности клеток периферической крови в норме и при различной патологии, в частности при лейкозах. Наиболее часто метод выявления числа аргирофильных ЯОР применяется для оценки пролиферативной активности злокачественных клеток [2]. Вместе с тем, публикаций, посвященных морфометрическому анализу клеток крови при инфекционных заболеваниях крайне мало [1].
Целью настоящей работы было изучение с применением компьютерного анализа состояния нуклеолярного аппарата и плотности конденсации хроматина в ядрах лимфоцитов периферической крови у больных хроническим описторхозом.
Мазки крови были получены от 5 больных с копроовоскопически подтвержденным диагнозом: хронический описторхоз, холангиохолецистит в стадии обострения. В качестве контрольной группы были обследованы 5 здоровых человек. Для выявления аргирофильных ЯОР и ядрышек в ядрах лимфоцитов был использован  метод, предложенный W.M. Howell и D.A. Black [3]. Кроме того, мазки крови фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимзе. С помощью цифровой фотокамеры Panasonic DMC-LS70 с разрешением 7,2 мегапикселей, установленной на тубус светового микроскопа, было сделано 96 фотографии мононуклеарных клеток в мазках периферической крови, полученных от больных людей, и 90 изображения этих клеток, полученных от здоровых людей. Для анализа цифровых изображений клеток была использована специальная компьютерная программы ImageJ, позволяющая оценить 18 различных параметров клетки, клеточного ядра, ядрышка и содержания компактного хроматина в ядре. Статистический анализ полученных данных был осуществлен с использованием программы Excel с применением t-теста Стьюдента и коэффициента ранговой корреляции  Спирмена.
У больных описторхозом и у здоровых лиц определяли процентное содержание лимфоцитов, в ядрах которых отсутствовали ядрышки или были выявлены один, два или три и более Ag-позитивных ЯОР. У больных хроническим описторхозом, по сравнению с контролем, было установлено достоверное уменьшение числа Ag-отрицательных клеток (10,63% против 1,75%, P<0,05). Достоверных изменений в числе нуклеол в клетке между лимфоцитами больных и здоровых людей выявлено не было. Вместе с тем, в лимфоцитах больных описторхозом и в контроле были проанализированы форма и размеры Ag-позитивных ЯОР. В лимфоцитах периферической крови у больных описторхозом, по сравнению с контролем, было установлено значительное увеличение числа крупных гомогенных Ag-позитивных ЯОР (90,62% против 44,4%, P<0,001) и уменьшение числа мелких точечных Ag-позитивных ЯОР (9,37% против 77,7%, P<0,001). В ходе оценки площади Ag-позитивных ЯОР (площади ядрышка) и площади ядра клетки было установлено прямая корреляционная зависимость между этими параметрами (r=0,465, P<0,01). В результате проведенного анализа все изученные изображения мононуклеарных клеток крови были разделены, в зависимости от площади ядра и с учетом ядерно-цитоплазматического соотношения, на 5 условных классов. К классу 1, классу 2 и классу 3 были отнесены узкоцитоплазменные лимфоциты с площадью ядра 29,62±4,22 мкм2, 38,54±4,08 мкм2 и 50,14±3,38 мкм2 соответственно. В класс 4 входили среднецитоплазменные лимфоциты с площадью ядра 65,82±9,44 мкм2. К классу 5  были отнесены большие широкоцитоплазменные лимфоциты и моноциты, имеющие площадь ядра 91,79±13,42 мкм2. Достоверных различий в распределении клеток по классам между лимфоцитами периферической крови больных хроническим описторхозом и контролем обнаружено не было. Проведена оценка площади Ag-позитивных ЯОР в лимфоцитах всех 5 классов у больных описторхозом и у контрольных лиц. В лимфоцитах, относящихся к классам 1 и 2, у больных описторхозом было установлено наиболее значительное увеличение этого показателя, по сравнению со здоровыми людьми (1,67±0,68 мкм2  против 0,88±0,23 мкм2, P<0,01; 2,268±0,79 мкм2 против 1,139±0,45 мкм2, P<0,01 соответственно). Подобные достоверные различия в площади Ag-позитивных ЯОР были установлены в лимфоцитах больных и здоровых людей, относящихся к классу 3 (3,08±0,7 мкм2 против 2,1±0,7 мкм2, P<0,05), к классу 4 (3,07±0,71 мкм2 против 1,77±0,62 мкм2, P<0,01) и к классу 5 (3,61±1,53 мкм2 против 2,13±1,059 мкм2, P<0,01), что, по-видимому, свидетельствовало о реакции размера ядрышка и увеличения образования Ag-позитивных ЯОР в ответ на антигенную стимуляцию.
Кроме того, в ядрах лимфоцитов в препаратах окрашенных азур II-эозином анализировали  общую площадь компактного хроматина (в мкм2), общее число и средний размер глыбок компактного хроматина (мкм) и долю компактного хроматина в общей площади ядра (в%).  У больных описторхозом в ядрах лимфоцитов класса 2, по сравнению со здоровыми людьми, было установлено достоверное повышение площади компактного хроматина и его доли в общей площади ядра (25,48±10,28 мкм2  против 13,22±7,76 мкм2, P<0,001; 58,39±21,7 % против 30,63±17,38 %, P<0,001 соответственно), которое происходило главным образом за счет увеличения  среднего размера глыбок компактного хроматина в ядре клетки (1,23±0,803 мкм против 0,53±0,47 мкм, P<0,01).  В ядрах лимфоцитов класса  3  у больных описторхозом, по сравнению с контролем, также было установлено существенное увеличение площади компактного хроматина и его доли в общей площади ядра (18,42±9,98 мкм2  против 5,32±1,84 мкм2, P<0,001; 33,14±18,22 % против 9,45±4,03 %, P<0,001 соответственно), которое происходило за счет увеличения  среднего размера глыбок компактного хроматина в ядре клетки (0,39±0,26 мкм против 0,18±0,02 мкм, P<0,01), а также числа этих глыбок (3676,45±675,53 против 2109,5±497,09, P<0,01), что, по-видимому, свидетельствовало о снижении функциональной активности этих клеток у больных людей, поскольку компактный хроматин соответствует спирализованным малоактивным участкам гетерохроматина, в противоположность тонкодисперсному, агранулярному  и функциональноактивному эухроматину. В ядрах лимфоцитов других классов существенных различий этих показателей между больными и здоровыми людьми установлено не было, что говорит о значительной функциональной гетерогенности иммунокомпетентных клеток.

Список литературы:
1.    Шилов, Б. В. Компьютерный морфометрический анализ структуры ядер лимфоцитов периферической крови человека в норме и при Эпштейн-Барр вирусной инфекции в условиях in vivo и in vitro : Автореф. дис. … канд. мед. наук / Б. В. Шилов – Томск, 2001. – 16 с.
2.    Nuclear organizer regions in lymphomas a quantitative study / H. Yekeler, M.R. Ozercan, A.Z. Yumbul et al // Pathologica. – 1993. – V. 85. – P. 353-360.
3.    Howell, W. M. Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a one step method / Howell W. M., Black D. A. // Experientia. – 1980. – V. 36. P. 101-105.