Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

АННОТАЦИЯ
Разработан новый методический подход к анализу ядрышек в клетках крови доноров, подвергающихся воздействию генотоксикантов. Обосновы-вается выбор  ФГА-стимулированных лимфоцитов для такого анализа. Предлагается особый "мягкий" режим окрашивания. Проведен сравнитель-ный анализ количества ядрышек в группах рабочих  Новокемеровской ТЭЦ и контрольных доноров. Обнаружено достоверно большее число яд-рышек в группе лиц, контактирующих с химическими мутагенами.

ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время в генетике бурно развивается такое направление как исследование структуры интерфазного ядра, его 3D-топологии, особенностей локализации отдельных хромосом и генов. Для этого используют специальные методы микроскопии (Spectral Precision Distance Microscopy) и целый арсенал молекулярно-генетических методов. Однако ещё в середине  XX века был предложен простой и недорогой способ выявления такой структуры ядра, как ядрышко. Данный метод основывается на окрашивании азотнокислым серебром негистоновых белков РНП [1]. Между тем известно, что на территории ядрышка локализованы акроцентрические хромосомы, рибосомные гены которых активно работают. С помощью FISH с пробой на 10 акроцентрических хромосом нами было показано, что число ядрышек в ядре соответствует числу групп, сбли-женных между собой акроцентриков в ядре [2]. Таким образом, изучение числа ядрышек может давать ценную информацию об особенностях локализации большой группы хромосом.
Особый интерес  представляют исследования, посвященные изучению структуры интерфазного ядра в условиях мутагенных, канцеро-генных воздействий. Многими авторами было показано, что  в опухолевых клетках число ядрышек значительно больше, чем в нормальных. Об-суждается диагностическая и прогностическая значимость данного показателя при различных формах онкопатологии. При исследовании ядрышек в лимфоцитах периферической крови   ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС установлено, что радиационное воздействие способно значи-тельно влиять на хромосомные территории в ядре, приводя к возрастанию числа наблюдаемых ядрышек [3]. Влияние химических мутагенов на ядрышковый аппарат клетки остается практически неизученным.
Наиболее распространенным способом учета ядрышек является их определение в нативных (не культивированных) клетках, т.к. такой подход позволяет исключить влияние условий культуральной среды и получать точное представление о количестве ядрышек в тех или иных клет-ках организма. При изучении лимфоцитов периферической крови (ЛПК) данный способ имеет ряд "минусов". Во-первых, при изучении мазков крови приходится просматривать значительное количество форменных элементов крови, выбирая лимфоциты, причём только с качественной окраской - этим значительно увеличивается время исследования и не исключена возможность ошибки в плане выбора клетки. Во-вторых, размер нативных лимфоцитов - 6-18 мкм, соответственно, размер изучаемых ядрышек - ещё меньше. Поэтому есть определенный риск, что мелкие яд-рышки визуально будут сливаться даже при максимальной разрешающей способности светового микроскопа.
При изучении влияния мутагенов важно не абсолютное количество ядрышек в нативных клетках, а их "сравнительное" количество в клетках, подвергавшихся воздействию и в контроле.  При проведении подобных сравнений удобным объектом исследования являются лимфоци-ты периферической крови, стимулированные ФГА. Методика культивирования ЛПК - старый и хорошо стандартизированный метод [4]. Известно, что через 48 ч культивирования свыше 80% процентов клеток - это лимфоциты в фазе G2. Учет ядрышек в таких клетках имеет ряд преимуществ:
1. более высокая скорость анализа, т.к. нет необходимости искать лимфоциты - на препаратах представлены только эти клетки;
2. стимулированные лимфоциты  - это достаточно крупные клетки (без дополнительных обработок - до 30 мкм, после обработки КСl - до 150 мкм), с большим количеством хорошо различимых ядрышек (от 1 до 7, по нашим наблюдениям);
3. ФГА-стимулированные лимфоциты - это клетки, перешедшие из фазы покоя в активное состояние, следовательно, ядрышки в таких клетках также "активные", отражающие  интенсивный биосинтез белка в клетке, что представляет несомненный интерес.
 Поэтому целью настоящего исследования явилось изучение методических особенностей выявления и анализа ядрышек в ФГА-стимулированных  лимфоцитах крови человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Получение препаратов Лимфоциты периферической крови 22 здоровых доноров, не контактирующих с профвредностями (студенты) и 29 рабочих Новокемеровской ТЭЦ  культивировали в присутствии ФГА по стандартному полумикрометоду [4]. Далее препараты готовили также как при подготовке препаратов хромосом [5].
Окрашивание препаратов. Селективную окраску ЯОР  азотнокислым серебром проводили по методу  W.M.Howell, D.A.  Black [6]   с некоторыми модификациями:
1 вариант: на стекло  наносили 150 мкл  50%-ного раствора нитрата серебра («Merck», Германия), 50 мкл деионизированной воды, 100 мкл 2%  раствора желатина в 0,1% муравьиной кислоте. Препарат накрывали покровным стеклом и инкубировали в термостате  в течение 12 мин при 550С. Затем промывали водопроводной водой и окрашивали 1% раствором красителя Гимза (3 мин).
2 вариант: окрашивание азотнокислым серебром (концентрация реактивов как в 1варианте) проводили 10 мин при 370С.
Учет показателей  На полученных препаратах можно выделить разные типы лимфоцитов (малые, промежуточные, лимфобласты). Для анализа брали самые крупные клетки (лимфобласты), с хорошо различимыми ядрышками.  Подсчитывали число клеток с 1-7 ядрышками (больше не наблюдали). Показатель «среднее число ядрышек в ядрах лимфоцитов» для каждого обследуемого определяли как арифметическое среднее. Для определения минимального и достаточного количества клеток для анализа учет проводили в диапазоне от 100 до 1000 клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ влияния условий окрашивания на результаты исследования проводили только в группе здоровых доноров. При использовании традиционных условий окрашивания ядрышкообразующих районов (при 550С) наблюдали меньшее число ядрышек (2,24±0,09; n=13), чем при окрашивании в более "мягких" условиях -   при 37 0С (2,90±0,26; n=9).  Следовательно, более адекватным является использование 2 варианта ок-рашивания, т.к. при воздействии высокой температуры часть ядрышек сливается, и результаты оказываются заниженными.
При определении количества клеток, необходимых для анализа, были получены следующие значения: среднее число ядрышек на 100 клеток - 2,36±0,12; на 200 клеток- 2,33±0,09; на 300 клеток - 2,35±0,11; на 400 клеток- 2,37±0,11; на 500 клеток - 2,36±0,11; на 600 клеток- 2,36±0,11; на 700 клеток - 2,34±0,12; на 800 клеток - 2,32± 0,12; на 900 клеток - 2,37±0,15; на 1000 клеток - 2,35±0,19.  Достоверных отличий между значениями, полученными при анализе 100 и большего числа клеток, не   обнаружено. Исходя из этого, можно сделать вывод, что для адекватного учета количества ядрышек достаточно анализировать по 100 клеток от каждого обследуемого донора.
В данной работе проводился сравнительный анализ количества ядрышек у рабочих Новокемеровской ТЭЦ, работающих в условиях по-стоянного мутагенного воздействия (угольная пыль, полициклические ароматические углеводороды, окиси серы, углерода и азота, ртути, никеля и ванадия, сернистый ангидрид, сероводород, аммиак) и  у здоровых доноров, не контактирующих с профессиональными вредностями. Режим ок-рашивания 10 мин. при 370С.   Учитывали по 100 клеток от каждого донора. Полученные результаты представлены в таблице 1 .

В лимфоцитах крови лиц, подвергающихся  воздействию химических мутагенов, было отмечено достоверное увеличение частоты встречаемости клеток с 5-7 ядрышками. В результате, среднее число ядрышек на ядро у рабочих НК ТЭЦ –   3.66 ± 0.09, а в контрольной группе достоверно меньше – 2.90 ± 0.26.
Таким образом, при воздействии химических мутагенов наблюдается увеличения количества ядрышек на ядро, также как при воздействии радиа-ции.  Для детального изучения данного процесса необходимо выполнение исследовательского проекта на больших выборках рабочих, контакти-рующих с различными типами мутагенов, параллельно с анализом индивидуального уровня хромосомных аберраций.
Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод о том, что использование ФГА-стимулированных лимфоцитов для оценки влияния мутагенов на формирование ядрышек является адекватным и информативным методом.

ЛИТЕРАТУРА
1.     Goodpasture C., Bloom S. Visualization of nucleolar organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining // Chromosoma. - 1975. - V. 53. -P.37-50.
2,Minina V., Trakhtenbrot L et al. The associacion of acrocentric chromosomes in interphase nuclei of neuroblastoma cell lines detected by FISH and Ag-NOR techniques/ Cytogenet. Cell Genet. -1999.- V.85. -N 1-2.
3. Ибрагимова Н.В., Туголукова Л.В. и др. Исследование количества ядрышек в ядрах периферической крови у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС // Цитоло-гия. 2001. Т. 43.  №10.
4. Hungerford D.F. Leucocytes cultured from smoll inocula of whole blood hypotonic KCl // Stain Technol.- 1965. - V.40.- P. 333-338.
5. Дружинин В.Г. Количественные характеристики частоты хромосомных аберраций в группе жителей крупного промышленного региона Западной Сибири // Генети-ка. - 2003. - Т.39. - №10.- С. 1373-1380
6. Howell W.M., Black D.A. Controlled silver-staining of nucleolus organizer  regions a protective colloidal developer: a 1-step method // Experienta. -1980. -V. 36.- P. 1014-1015.