Писарев1 В.Б., Снигур1 Г.Л., Спасов2 А.А., Самохина2 М.П.
Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра патологической анатомии1, кафедра фармакологии2.

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Проблемы и перспективы современной науки» (выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Сахарный диабет (СД) является распространенным заболеванием эндокринной системы и глобальной медико-социальной проблемой здравоохранения. Ранняя инвалидизация и наличие поздних осложнений диабета способствуют высокой летальности [1]. Экспертная оценка распространенности сахарного диабета позволяет считать, что к 2010 году в мире будет насчитываться более 230 млн. больных сахарным диабетом, при этом 80-90% составят больные инсулиннезависимым типом сахарного диабета.
Активный поиск новых антидиабетических средств может быть успешным только в случае чёткого понимания всех механизмов повреждения В-клеток. Изучение механизмов действия новых антидиабетических препаратов является одним из важных направлений современной диабетологии и фармакологии.
Известно, что ряд химических веществ (аллоксан, стрептозотоцин, хлорозотоцин, ципрогептадин и др.) вызывают селективную деструкцию В-клеток панкреатических островков. Некоторые из них (аллоксан, стрептозотоцин) широко используются для моделирования СД [7]. Цитотоксический эффект этих веществ вызывает повреждение В-клеток как у человека, так и у лабораторных животных (крысы, мыши, собаки) [8]. В зависимости от применяемой в эксперименте дозы цитотоксинов возможно моделирование различных состояний нарушения углеводного обмена, соответствующих определенным клиническим классам диабета (явный сахарный диабет различной формы: инсулинзависимый и инсулиннезависимый, нарушенная толерантность к углеводам или скрытый диабет).
Механизмы действия В-цитотоксинов неодинаковы, т.к. их повреждающее влияние осуществляется посредством нескольких путей: генерации свободных радикалов кислорода, нарушающих эндогенные процессы защитной функции клетки; формирования разрывов ДНК с последующей активизации поли-АДФ-рибозо-синтетазы, угнетение активного транспорта кальция и кальмодулинактивированной протеинкиназы.
Несмотря на многолетнюю историю применения аллоксана в качестве диабетогенного агента, некоторые механизмы клеточного повреждения, обусловленной его введением, изучены не в полном объёме.
Целью исследования явилось уточнение механизмов токсического действия аллоксана на В-клетки панкреатических островков крыс.
Методика исследования:
Исследование проводили на 20 белых крысах-самцах, массой 300-340 г., разделенных на две группы. Животным опытной группы осуществляли однократную внутрибрюшинную инъекцию аллоксана в дозе 120 мг/кг. Контролем являлись интактные крысы, содержавшиеся в стандартных условиях вивария. Протокол экспериментальной части исследования согласован с Региональным этическим комитетом (решение №43-2006). Спустя 7 дней животных выводили из эксперимента, изготавливали микропрепараты поджелудочной железы по общепринятым гистологическим методикам с последующей окраской гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование выполняли на базе лаборатории морфологии и иммуногистохимии отдела общей и эксперементальной патологии Волгоградского научного центра РАМН. Были использованы моноклональные антитела к каспазе 3 (клон JHM62), протеину MDM2 (клон 1B10), NO-синтазе-3 (клон RN5), TNF-апоптоз индуцирующему лиганду (TRAIL, клон 27B12) (Novocastra, Великобритания) и белку Bcl-2 (клон sc-7382, Santa Cruz, США) и поликлональных антител к белкам p53 (DakoCytomation, Дания) и Bax (BD Pharmingen, США). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода.
Результаты исследования и их обсуждение:
В группе интактных животных поджелудочная железа имела альвеолярно-трубчатое строение с четким разделением на дольки тонкими прослойками соединительной ткани. Островки Лангерганса располагались вблизи выводных протоков. В эндокриноцитах панкреатических островков отмечалось негативное окрашивание к NO-синтазе-3, TRAIL, p53 и Bax. В центральных отделах островков отмечалось наличие единичных слабо Bcl-2-позитивных эндокриноцитов. В большинстве клеток островков Лангерганса определялись эндокриноциты с MDM2-позитивными ядрами.
При аллоксан-индуцированном СД в поджелудочной железе отмечался отёк междольковой соединительной ткани и полнокровие кровеносных капилляров. Панкреатические островки были умеренно коллабированы с выраженным полнокровием капилляров. В отдельных эндокриноцитах, расположенных в центральных отделах отмечались признаки деструкции. Отмечалось негативное окрашивание к белку p53, TRAIL и NO-синтазе-3. Цитоплазматическая экспрессия Bcl-2 носила слабо выраженный характер. В большинстве эндокриноцитов выявлялась умеренная экспрессия каспазы 3 и Bax. Ядерное окрашивание к белку MDM2 отмечалось в незначительной части клеток, расположенных преимущественно в периферических отделах островков Лангерганса.
Избирательная цитотоксичность аллоксана обусловлена образованием активных форм кислорода и перекиси водорода, что приводит к окислению SH-групп белков и повреждению ДНК в-клеток панкреатических островков. Участие оксида азота (NO) в цитотоксическом эффекте аллоксана остается спорным, так как низкая концентрация NO в в-клетках ингибирует индуцибельные формы NO-синтазы и уменьшает повреждение ДНК [4].
Важным эффектом аллоксановой цитотоксичности является нарушение интрацеллюлярного гомеостаза кальция. Увеличение концентрации цитоплазматического кальция в клетках панкреатических островков подтверждено в экспериментах in vitro и in vivo. Этот эффект обусловлен избыточным поступлением кальция из внеклеточной жидкости и его мобилизацией из внутриклеточных депо, т.к. аллоксан вызывает деполяризацию клеточных мембран и мембран митохондрий В-клеток [3, 8]. Таким образом, грубое повреждение внутриклеточных структур свободными радикалами, окисление SH-групп белков и нарушение внутриклеточного гомеостаза кальция сопровождается развитием некроза.
Однако гибель В-клеток может быть обусловлена активацией апоптоза. Известно, что одним из пусковых факторов апоптоза являются повреждения ДНК или повреждение внутриклеточных мембран митохондрий в результате действия сильных окислителей. В реализации механизмов клеточной гибели важнейшее положение занимает белок р53 и семейство цитоплазматических протеаз – каспаз. Белок р53 является ключевым звеном в развитии апоптоза, однако существуют механизмы запрограммированной клеточной гибели без участия данного белка (механизм действия фактора некроза опухоли). Белок MDM2 наоборот предохраняет клетку от апоптоза, путем ингибиции синтеза р53 и ускорения его распад в цитоплазме [2].
Каспазы образуют разветвленный каскад, взаимно активируя друг друга [9]. Активация каспазного каскада возможна с помощью сигнала полученного от цитолеммы (каспаза 8) или в результате митохондриальных факторов (каспаза 9). Каспазы 8 и 9 активируют эффекторную каспазу 3, после чего процесс клеточной смерти, оказывается необратимым [5].
В то же время, активация апоптоза возможна и без участия каспаз: сверхсинтез белка-промотора апоптоза Вах приводит к дестабилизации мембран митохондрий и индуцирует апоптоз. Проницаемость мембран митохондрий регулируется белками семейства Bcl-2/Bax. Протеин Bcl-2 снижает проницаемость мембран и тем самым ингибирует апоптоз, а Bax наоборот повышает проницаемость. Таким образом, митохондриальная ветвь апоптоза может запускаться белком Bax. Белок Bcl-2 прямо или косвенно предотвращает высвобождение из митохондрий цитохрома С, который активирует прокаспазу 9 [6].
Таким образом, цитотоксический эффект аллоксана реализуется за счёт развития двух процессов клеточной гибели: некроза и апоптоза. Некротические процессы обусловлены преимущественно действием свободных радикалов и окислением SH-групп белков. Активация апоптоза протекает без участия белка р53 и осуществляется за счёт нарушения гомеостаза внутриклеточного кальция и дестабилизации мембран митохондрий с последующей активацией каспазного каскада.

Список литературы:
1. Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений. – М.: Медицина, 2005.
2. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. – М.: «МИА», 2003.
3. Elsner M., Tiedge M., Guldbakke B. et al. Importance of the GLUT2 glucose transporter for pancreatic beta cell toxicity of alloxan. // Diabetologia. - 2002. – Vol.45. - №11. - P. 1542-9.
4. Kroncke K.D., Fehsel K., Sommer A., et al. Nitric oxide generation during cellular metabolization of the diabetogenic N-methyl-N-nitroso-urea streptozotozin contributes to islet cell DNA damage. // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. - 1995. Vol.376. - №3 - P. 179-185.
5. Nakayama T., Hattori M., Uchida K., et al. The regulatory domain of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor is necessary to keep the channel domain closed: possible physiological significance of specific cleavage by caspase 3. // Biochem J. - 2004. Vol.377. - №2. - Р. 299-307.
6. Selvakumaran M., Lin H.K., Miyashita T. et al. Immediate early up-regulation of bax expression by p53 but not TGF beta 1: a paradigm for distinct apoptotic pathways. // Oncogene. - 1994. - Vol.9. - №6. - P. 1791-1798.
7.  Srinivasan K., Ramarao P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. // Indian J. Med. Res. - 2007. - Vol.125. - №3. - P. 451-472.
8. Szkudelski T. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B Cells of the Rat Pancreas // Physiol. Res. - 2001. - Vol.50. - №6. - P. 536-546.
9. Wilson B., Mochon E., Boxer L. Induction of bcl-2 expression by phosphorylated CREB proteins during B-cell activation and rescue from apoptosis. // Mol. Cell. Biol. - 1996. - Vol.16. - №10. - P. 5546-5556.