|
ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (г. Томск)
Эта работа опубликована в сборнике "Науки о человеке": материалы IX
конгресса молодых ученых и специалистов (Томск, 28-29 мая 2010 г) / Под ред. Л.М.
Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2010. – 113 с.
Посмотреть обложку сборника
Скачать сборник целиком
Известно, что любой патологический процесс, в том числе и внутриглазная пролиферация, первоначально реализуется на клеточном уровне, сопровождаясь изменениями ультраструктуры и метаболизма клеток. Важную роль при этом играют факторы микроокружения. Возможно, одним из подобных локальных факторов является направленное движение внутриглазной жидкости в полости глазного яблока, создаваемое градиентом давления.
Цель работы - исследование внутриклеточного метаболизма стромальных стволовых клеток человека в условиях направленного движения жидкости, сходного с движением жидкости в полости глаза. Материал и методы. Исследование проводили с помощью оригинального устройства, позволяющего in vitro моделировать движение питательной среды, сходное с движением жидкости в полости глазного яблока. Устройство представляет собой замкнутую систему с камерой, содержащей полупроницаемый фильтр. Систему предварительно заполняли питательной средой IMDM (ДМЕМ в модификации Iscove), объемом 200 мл, к которой добавляли 4% р-р гентамицина (0,02 мл на каждые 10 мл питательной среды). В качестве объекта исследования была выбрана культура стромальных стволовых клеток человека после 3-4 пассажей в концентрации 5-104 клеток/мл. Клеточный материал вводили в камеру и помещали на фильтр. Камеру соединяли с емкостью через роликовый насос, благодаря его работе создавалось равномерное направленное движение питательной среды со скоростью 2,1 -2,4 мм3/мин. Клеточную культуру инкубировали при постоянном движении жидкой питательной среды. В качестве контроля изучаемые клетки культивировали на полупроницаемом фильтре, помещенном в чашку Петри с необходимой питательной средой, при строгом соблюдении температурного режима (37°С), содержания С02 (5 - 7%) и уровня влажности (100%). Длительность проточного культивирования составила 48 часов. Клетки, культивируемые в стандартных условиях, исследовали через 24 и 48 часов. По окончании экспериментов клеточный материал, находящийся на полупроницаемом фильтре, исследовали с помощью цитохимических методов. Обнаруживали активность щелочной фосфатазы и а-нафтилацетатэстеразы.
Результаты. При культивировании культуры стромальных стволовых клеток человека в стационарных условиях на протяжении всего периода наблюдений (48 ч) цитохимически в клетках отмечалась активность а-нафтилацетатэстеразы (табл. 1). При этом с увеличением срока исследования незначительно повышалась плотность распределения клеток на искусственной поверхности, их оптическая плотность, однако, средняя площадь окраски на а-нафтилацетатэстеразу статистически значимо уменьшалась и соответствовала диаметру клеток в пределах 10 мкм. Щелочная фосфатаза в культивируемых клетках в стационарных условиях не выявлялась. В проточной культуре количество клеток на фильтрах, окрашивающихся на а-нафтилацетатэстеразу, оказалось существенно сниженным (практически в 10 раз) по сравнению со стандартным культивированием.
|
Таблица 1
Цитохимическая активность стромальных стволовых клеток человека при различных способах и
времени краткосрочного культивирования в минимальной питательной среде, Х (у.е.о.п.), p
|
| Сроки исследования, сутки |
Метод культивированияклеток |
Изучаемый фермент, n=10 |
| НЭ |
ЩФ |
| 1 |
Стационарный |
22,56 |
0 |
| Проточный |
19,34* |
9,28** |
| 2 |
Стационарный |
26,98 |
0 |
| Проточный |
20,97* |
14,67** |
Примечание. * - уровень статистической значимости различий p > 0,05, ** - уровень статистической значимости различий p < 0,005; n - число просчитанных полей зрения на фильтре. Для каждой группы использовали 3 фильтра. НЭ - а-нафтилацетатэстераза; ЩФ - щелочная фосфатаза.
Кроме того, ко 2-м суткам эксперимента статистически значимо повышалось восприятие красителя для щелочной фосфатазы (табл.1). Позитивно окрашивающиеся клетки имели большую, по сравнению с окраской на а-нафтилацетатэстеразу, площадь, неправильную форму, располагались, как правило, в углублениях поверхности.
Обсуждение. Известно, что все макромолекулы поступают в клетку путем эндоцитоза. При этом, чем выше скорость направленного движения жидкости через клетку, тем интенсивнее происходит процесс эндоцитоза и тем, соответственно, большее количество веществ поступает внутрь клетки. Это, в свою очередь, определяет степень ее метаболической активности. Кроме того, на основании показателей внутриклеточного обмена можно судить о состоянии клеток, направлении и интенсивности их деятельности. Так, каждая стадия дифференцировки неразрывно связана с активацией дополнительных ферментных систем, налаживанием новых механизмов биосинтеза. Данные цитохимических исследований стромальных стволовых клеток человека, культивируемых в проточных условиях, по сравнению с показателями в статических условиях свидетельствуют о повышении активности как специфических (щелочная фосфатаза), так и неспецифических (а-нафтилацетатэстеразы) ферментных систем, что указывает на ускорение процесса дифференцировки клеток. Подтверждением этому служит и более существенное по сравнению с контролем уменьшение площади клеточной поверхности культивируемых в проточных условиях клеток как отражение степени их созревания.
Выводы. Таким образом, в нашем эксперименте доказана возможность ускорения дифференцировки и созревания стромальных стволовых клеток человека посредством биомеханического воздействия направленного потока жидкости. Подобная технология может иметь как фундаментальное значение, связанное с изучением механизмов модификации морфофункциональных свойств клеток, так и практический выход, позволяющий наращивать массу дифференцированных клеток посредством технологии "биореактор in vitro".
|
