Сахарный диабет 1 типа является одной из важных медико-социальных проблем здравоохранения практически всех стран мира. Это обусловлено прогрессивным ростом заболеваемости, ранней инвалидизацией и смертностью больных, главным образом в связи с развитием сосудистых осложнений. К приоритетным направлениям медицины относятся поиски новейших технологий для выделения групп риска по диабету и его осложнениям, а также разработка программ реабилитации больных диабетом.
В настоящее время стратегия определения генов подверженности к мультифакториальным заболеваниям направляет генетические исследования в русло поиска возможных генов - кандидатов и изучения их вклада в развитие патологии человека. Важную роль в патогенезе сосудистых осложнений сахарного диабета 1 типа (СД1) играет эндотелиальная дисфункция, поэтому выявление генетических маркеров, участвующих в ее детерминации может иметь прогностическую ценность для ранней диагностики данной патологии. Синтез оксида азота (МЭ) осуществляется семейством цитохром Р-450-подобных гемопротеинов - NO синтаз (NOS). Различают 3 формы NO синтаз: нейрональную (nNOS), индуцибельную (iNOS) и эндотелиальную (eNOS), которые кодируют соответствующие гены: NOS1 , NOS2 и NOS3. Данные гены идентифицированы, установлена их экспрессия в различных клетках и тканях, а также их взаимосвязь с различной патологией человека. Ген нейрональной синтазы оксида азота - NOS1, локализован на 12 хромосоме человека и состоит из 29 экзонов и 28 интронов, размером более 200 kb. NOS1 постоянно экспрессируется во многих тканях, включая нейроны периферической и центральной нервной системы, скелетные мышцы и клетки эпителия легких. В клетках эндотелия сосудов находится зависимая от Ca2+ и кальмодулина неиндуцируемая NO-синтаза, ген которой (NOS3) расположен на 7 хромосоме. Вырабатываемый eNOS оксид азота является самым мощным из известных эндогенных вазодилататоров. Патогенетическая роль эндогенного оксида азота при СД 1 изучается с двух точек зрения: как фактора участвующего в развитии самого заболевания, и как фактора, аномальная экспрессия которого играет заметную роль в формировании ангиопатий. Эксперименты с различными клеточными культурами показали, что повреждающему действию NO наиболее подвержены клетки островков Лангенгарса, деструкция которых является ключевым звеном развития СД 1. Данные о роли оксида азота в патогенезе диабетических ангиопатий достаточно противоречивы. Гены синтазы оксида азота NOS1(нейрональная синтаза оксида азота) и NOS3 (эндотелиальная синтаза оксида азота) могут быть рассмотрены в качестве кандидатных, как в развитии сахарного диабета 1 типа, так и его осложнений. Цель исследования
Изучить взаимосвязь полиморфных вариантов генов NOS1 (полиморфизм С/Т в 18 экзоне) и NOS3 (VNTR полиморфизм, полиморфизм C691T, полиморфизм C774T и полиморфизм G894T), с патологическим фенотипом - сахарным диабетом 1 типа и сосудистыми осложнениями на популяционном и семейном уровнях.
Материалы и методы
Было обследовано 170 семей детей больных сахарным диабетом 1 типа. Контрольную группу составили 122 человека, принадлежащих к русскому населению г. Томска и не имеющих по данным клинического, инструментального обследования сахарного диабета и признаков сердечно-сосудистых нарушений. Выделение тотальной ДНК проводили с помощью стандартного метода с некоторыми модификациями. Изучение полиморфных вариантов исследуемых генов проводили с помощью амплификации соответствующих участков генома методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в геномной базе данных (GDB) и литературе. Генотипирование полиморфизмов осуществляли путем ПДРФ-анализа: продукты амплификации обрабатывали рестриктазами с последующим разделением в 3% агарозном геле. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете с применением компьютерной видеосъемки на приборе "UV-VIS Imager-II" (США). При описании генетической структуры популяций использовали следующие методы: тестирование на соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга (РХВ); сравнение частот аллелей между группами проводили точным тестом Фишера. Для поиска ассоциации патологии с генетическими маркерами был использован тест на не равновесие по сцеплению - Transmission / Diseqilibrium Test (TDT): TDT=(b-c)2/(b+c), где b и c наследуемые аллели от гетерозиготных родителей. Все расчеты по приведенным формулам выполняли в компьютерных пакетах прикладных программ STATISTICA 5.0, Microsoft Excel-0 97.
Результаты и обсуждения
Наблюдаемое и ожидаемое распределение генотипов и частот аллелей изучаемых полиморфных вариантов генов NOS1 и NOS3 соответствовало РХВ для всех полиморфных вариантов, за исключением VNTR гена NOS3 (%2=4,106; р<0,05) за счет недостатка гетерозигот.
Анализ методом "случай-контроль" (больные сахарным диабетом - здоровые лица) показал отсутствие взаимосвязи (RR<1) VNTR полиморфизма и варианта G894T гена NOS3 с заболеванием, и наличие статистически значимой ассоциации полиморфизма С/Т в 18 экзоне гена NOS1 (RR=1,600; р=0,007), полиморфизма C691T гена NOS3 (RR=1,990; р=0,010), полиморфизма C774T гена NOS3 (RR=2,230; р=0,007) с сахарным диабетом 1 типа. Выявлено значимое различие в частотах аллелей между больными сахарным диабетом и здоровыми лицами для полиморфизма С/Т гена NOS1 (х2=7,198, р=0,007), полиморфизмов C691T (Х2=6,576, р=0,010) и C774T гена NOS3 (х2=10,250, р=0,007).
Поиск ассоциаций на семейном уровне с помощью TDT-теста показал, что аллель В VNTR полиморфизма, аллель С варианта С774Т и аллель G полиморфизма G894T гена NOS3 ассоциируются с сахарным диабетом 1 типа, при этом показатель TDT составил 2,7 (р=0,074), 4,2 (р=0,016) и 3,3 (р=0,060) соответственно. Особое значение в полученных ассоциациях принадлежит полиморфизму С774Т расположенному в экзоне 6 гена NOS3. Для полиморфизма С/Т в 18 экзоне гена NOS1 не выявлено статистически достоверной ассоциации аллеля С с сахарным диабетом 1 типа (TDT=2,56; р=0,109).
Анализ вклада исследуемых кандидатных генов в развитие диабетических микроангиопатий: нефропатии и ретинопатии показал, что аллель А VNTR полиморфизма гена NOS3 реже встречается у больных сахарным диабетом с нефропатией (р=0,041) и является фактором достоверно, хотя и незначительно, уменьшающим риск (RR=0,13) развития последней. Исследование наследования аллелей А и В от гетерозиготных родителей выявило, что аллель В ассоциируется с диабетической нефропатией, при этом показатель TDT составил 4,50;
(р=0,034).
Таким образом, генетическими маркерами сахарного диабета 1 типа является наличие у индивидов аллелей В VNTR полиморфизма гена NOS3, С полиморфизма С774Т гена NOS3, G полиморфизма G894T гена NOS3; а сосудистого неблагополучия при сахарном диабете 1 типа: диабетической нефропатии - аллеля В VNTR полиморфизма гена NOS3.