|
ГОУВПО СибГМУРосздрава (г. Томск)
Эта работа опубликована в сборнике "Науки о человеке": материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М.
Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2008. – 135 с.
Посмотреть обложку сборника
Скачать сборник целиком
Введение. В последнее время широко обсуждается механизм включения активных форм кислорода (АФК) в регуляцию ионтранспортных систем клетки. Так, активные кислородные радикалы, образующиеся при активации мембраносвязанной НАДФН-оксидазы, могут включаться в регуляцию Са2+-активируемых калиевых каналов эозинофилов [1] Известно ингибирующее влияние супероксид-аниона на Са2+- АТФ-азу саркоплазматического ретику-лума гладкомышечных клеток сосудов. Традиционной моделью для изучения ионного транспорта служат клетки красной крови. Мембрана эритроцитов содержит только один тип каналов, а именно Са2+-активируемые калиевые каналы, что позволяет проводить исследования на суспензии интактных эритроцитов. Регуляция Са2+ -активируемых калиевых каналов эритроцитов осуществляется несколькими путями, один из которых связан с редокс-агентами (HS-глутатион, НАДН и НАДФН) [2]. Образование активных форм кислорода осуществляется либо ферментативным путем, обусловленным, например, ксантиноксидазой, либо неферментативным способом, в частности, при переносе электронов в электронно-транспортной цепи. Не исключено, что активные формы кислорода вмешиваются в регуляцию Са2+-активируемых калиевых каналов.
Материалы и методы. В работе использовалась кровь 18 практически здоровых доноров. Для исследования Са2+ - активируемых калиевых каналов был применен метод регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов по изменениям рН среды инкубации в присутствии протонофора, основанный на том, что в этих условиях распределение протонов зависит от мембранного потенциала. Добавление кальциевого ионофора А23187 к суспензии клеток, содержащей 10 мкМ СаСl2, приводило к выходу ионов калия и развитию гиперполяризационного ответа (ГО) мембраны эритроцитов. Амплитуда ГО характеризует активность Са2+-зависимых калиевых каналов. Эритроциты инкубировались в присутствии 100 мкМ ксантина и 10 ми/мл ксантиноксидазы. Продукцию супероксид-аниона оценивали спектро-фотометрически по степени восстановления цитохрома с при 550 нм. Во второй серии экспериментов в среду инкубации эритроцитов добавлялась перекись водорода в концентрациях 0,05; 0,1; 0,5 и 1 мкМ, в ряде случаев эритроциты предварительно обрабатывались проникающим ингибитором каталазы аминотриазолом (0,026 М). Контрольные значения параметров принимались за 100%.
Для оценки влияния изученных факторов на параметры гиперполяризационного ответа эритроцитов рассчитывались средние значения каждого параметра, определялась ошибка среднего. Для оценки достоверности различий использовался непараметрический критерий U-Манна-Уитни либо непараметрический критерий Вилкоксона.
Результаты исследования и их обсуждение. Для изучения влияния АФК на калиевую проницаемость были проведены эксперименты по определению амплитуды ГО эритроцитов в присутствии системы ксантин - ксантиноксидаза. Наибольшее снижение амплитуды ГО отмечалось при инкубации эритроцитов в указанных условиях в течение 30 мин: (Рис.1 А). По данным спектрофотометрических исследований максимальная продукция супероксид-аниона наблюдалась через 10 мин инкубации ксантина и ксантиноксидазы и составила 9 мкМ, а O2- практически не проникает через мембрану клеток. Другим продуктом ксантинок-сидазной реакции является Н2О2, которая легко проникает внутрь клеток. Вероятно, что снижение Са2-активируемой калиевой проницаемости эритроцитов, прединкубированных с системой ксантин-ксантиноксидаза, обусловлено влиянием перекиси водорода.
Для проверки этого предположения были проведены эксперименты с добавлением перекиси водорода (0,05; 0,1; 0,5 и 1 мкМ) в среду инкубации эритроцитов. Достоверное снижение амплитуды ГО обнаруживалось в присутствии 0,5 мкМ и 1 мкМ перекиси водорода в среде инкубации (Рис. 1Б).
Рис. 1. Влияние продуктов системы ксантин и ксантиноксидазы (А) и перекиси водорода (Б) на параметры гиперполяризационного ответа эритроцитов. ^-обозначены параметры, достоверно отличающиеся от контрольных с р<0,05
В ряде экспериментов эритроциты перед добавлением различных концентраций Н2О2 обрабатывались 0,026 М аминотриазола. В присутствии этого агента амплитуда ГО эритроцитов достоверно снижалась при всех выбранных концентрациях Н2О2 (Рис.1Б). Этот эффект, видимо, связан с ростом концентрации перекиси в цитозоле эритроцитов.
Возможно, что наблюдаемые эффекты в присутствии перекиси водорода связаны с изменением SH- групп белков самого канала или белков цитоскелета. Это подтверждается тем, что ранее были получены сведения о снижении амплитуды гиперполяризационного ответа в присутствие модификаторов SH-групп [3]. Кроме того, имеются данные о влиянии протеин-киназы С на Са2+ -активируемые калиевые каналы, активность которой меняется в присутствии АФК. Не исключено, что обнаруженные в данном исследовании эффекты реализуются через изменение активности этого фермента в присутствии перекиси водорода. Не исключено, что определенный вклад в обнаруженный эффект внесло и подавление активности Na+,K+- АТФазы активными формами кислорода, приводящее к диссипации градиента ионов калия, что вызывает снижение амплитуды ГО.
Таким образом, данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют, что активные формы кислорода, в частности, перекись водорода, вмешиваются в регуляцию Са2+- активируемых калиевых каналов. Свое действие на Са -активируемую калиевую проницаемость эритроцитов АФК могут реализовывать различными путями, влияя на SH- группы белков канала или цитоскелета, модулируя активность протеинкиназы С, либо подавляя активность Na+,K+- АТФазы.
Список литературы:
1. Исследование механизмов регуляции Са -активируемой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов / И.В. Петрова, С.А. Бородина, М.Б. Баскаков., В.Е. Гольд-берг // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. - 1992. - Т.5. - С. 90-96.
2. Изучение природы гиперполяризационного ответа эритроцитов, индуцированного системой аскорбат - феназинметосульфат /Ситожевский А.В, Кремено С.В., Коваленко Н.В., Карпов Р.С.// Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова.-2006. Т.92. № 4. С. 461 - 470.
3. Колосова М. В. Роль внутриклеточных сигнальных систем в регуляции Са -активируемых калиевых каналов эритроцитов /М. В. Колосова, И. Б. Соколова, В. В Новицкий., М. Б. Баскаков, М. А. Медведев//Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 1997. - Т.124, N 6 С. 653 - 655.
|
