|
СГМУ, г. Томск
Эта работа опубликована в сборнике "НАУКИ О ЧЕЛОВЕКЕ" – Сборник статей молодых ученых и специалистов /Под ред. Л.М. Огородова, Л.В. Капилевич. – Томск, СГМУ.- 2002.-254 с.
Скачать сборник целиком
Одной из наиболее значимых целей молекулярных технологий конца ХХ века является определение нуклеотидной последовательности геномных ДНК. В настоящее время разработаны очень мощные методы физического анализа отдельных белков, белковых агрегатов и более сложных надмолекулярных комплексов. Это прежде всего методы масс-спектрометрии, ядерно-магнитного резонанса, рентгеноструктурного анализа. Наиболее удобными для изучения связи между первичной структурой белка и его биологической функцией являются сайт-специфические эндонуклеазы (ССЭН), которые явились последней и решающей предпосылкой для развития генной инженерии.. Эндонуклеазы рестрикции II класса являются наиболее распространенными и наиболее изченным в настоящее время классом среди всех нуклеаз[1,4].
Целью данной работы явилось изучение структурной основы каталитической активности нативно и мутантного форм ЭР Recо29.
Материалы и методы Штаммы бактерий: E.coli K802, E.coli Z85; фаги: cp80vir, Xvir. плазмиды pUC128/129, pQE-29. Выращивание бактерий проводили в среде LB в условиях интенсивной аэрации при 370С. Препараты фагов cp80vir, Xvir получали по стандартной методке [2].Выделение плазмидной ДНК проводили методом кипячения и извлечения ДНК из легкоплавкой агарозы. Для получения ДНК в масштабных количествах проводили лизис щелочью с последующей ее очисткой градиенте CsCl[2]. Получение мутантных штаммов по 49,76,142,154 аминокислотам поводили с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием ПЦР[4]. Специфичность ферментов определяли сравнивая электрофореграммы, полученные после гидролиза субстратных ДНК изучаемыми ССЭН и эталонными ферментами с известными сайтами узнавания. Нуклеотидную последовательность нативных и мутантных форм REco29 определяли методом секвенирования по Сенжеру[3].
Результаты и обсуждения Методом олиготид-направленного мутагенеза с использованием ПЦР были получены мутантные формы Y49A, Y76A, E142A и N154A гена REco29 локализованного на плазмиде pECO29CmSna и Y49A и E142A локализованного на p29QE1. Методом Сенгера определена нуклеотидная последовательности ДНК мутантных клонов и подтверждено, что замены Y49A, Y76A, E142A и N154A произошли соответственно. При проверке каталитической активности оказалось,что мутанты Y49A, Y76A, E142A и N154A REco29 не способны гидролизовать ДНК фага cp80vir, что свидетельствует о возможном участии этих аминокислотных остатков в катализе.
Литература
1. Pertzev A.V, Ruban N.M., Zakharova M.V., Beletzkaja I.V., Petrov S.I., Kravetz A.N., Solonin A.S. Eco29kI, a novel plasmid encoded restriction endonuclease from Escherichia coli. // Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 1991.
2. Sambrook J., Frith E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. //Cold Spring Harbor Lab. Press.
New York. 1989.
3. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.
4. Патрушев Л.И. Экспрессия генов.//М. Наука., 2000г.
|
