Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 70-й Юбилейной итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 16-18 мая 2011 г.), под ред. В. В. Новицкого, Л. М. Огородовой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2011. − 430 с.

 

Скачать сборник (формат MS Word, 7,3 мб)

Посмотреть основную информацию о сборнике, обложку и т.д.

 

Актуальность: аденозин – эндогенный пуриновый нуклеозид, один из промежуточных метаболитов АТФ. В нормальных физиологических условиях его уровень в межклеточном пространстве относительно низок. Содержание аденозина существенно возрастает при воспалении, в результате повреждения клеток, а также при недостаточном снабжении тканей кислородом. Аденозин оказывает свое влияние на клетки через аденозиновые рецепторы. В экспериментах in vitro было обнаружено, что аденозин снижает способность зрелых дендритных клеток, полученных из моноцитов периферической крови человека, индуцировать Т клеточную пролиферацию[1]. Дендритные клетки – профессиональные антиген-распознающие и антиген-представляющие клетки. В нормальных условиях зрелые дендритные клетки индуцируют специфический иммунный ответ, а незрелые обладают иммуносупрессивными свойствами[2]. Представляет интерес изучение молекулярных механизмов, опосредующих эффект аденозина, а также роли аденозиновой регуляции в процессе формирования дендритных клеток из клеток предшественников костного мозга.

Цель работы: состояла в изучении эффектов стимуляции аденозиновых рецепторов на формирование функциональных свойств дендритных клеток в процессе их дифференцировки и созревания из костномозговых предшественников.

Материалы и методы: в работе были использованы клетки костного мозга полученные из бедренных и большеберцовых костей 10 мышей линии С57BL/6. Культивирование клеток проводили в среде RPMI с добавлением 10нг/мл интерлейкина-4 и 10нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, в присутствии негидролизуемого аналога аденозина (100 μМ NECA) или его растворителя DMSO. На 6-ой день инкубации, для созревания дендритных клеток, в культуру добавляли липополисахарид в концентрации 5мкг/мл. Оценку функциональной активности иммунокомпетентных клеток проводили с использованием  смешанной культуры лимфоцитов. Определение активности аргиназы проводили спектрофотометрическим методом по превращению L-аргинина в мочевину. Активность индуцированной NO-синтазы в супернатантах культур дендритных клеток оценивали спектрофотометрически по количеству нитрита. Общая РНК была выделена из клеток набором RNeasy Mini kit (Qiagen,США) по инструкции производителя. Уровень экспрессии матричной РНК Аргиназы и iNOS опредеяли с помощью полимеразной цепной реакции в реальной времени на ABI PRISM 790HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, США).

Рис. 1. Эффект стимуляции аденозиновых рецепторов на активность и экспрессию мРНК аргиназы(А) индуцибельной NO-синтазы(Б) дендритными клетками, полученными в отсутствии(ДК) и присутствии аденозина(АДДК).

Результаты и обсуждение: мы обнаружили, что зрелые дендритные клетки (после стимуляции с ЛПС) полученные в присутствии негидролизуемого аналога аденозина NECA обладают сниженной  способностью индуцировать пролиферацию аллогенных Т клеток.  (данные не представлены) С целью определения молекулярных механизмов, обуславливающих низкую эффективность аденозин дифференцированных дендритных клеток (АДДК) в стимуляции Т клеточной пролиферации, мы исследовали активность индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и аргиназы.  Аргинин – заменимая аминокислота, является общим субстратом для этих ферментов. Аргинин необходим для активной пролиферации в том числе и иммунокомпетентных клеток, локальное снижение его концентрации приводит к подавлению деления и роста клеток. В результате проведенных исследований мы установили, что активность iNOS у АДДК была снижена по сравнению с культурой  дендритных клеток, полученных в отсутствии аденозинового аналога (352,6±15,3 и 413,5±19,4 мкМ нитрита натрия/мл соответственно, р=0,0242). (Рисунок1) Однако уровень экспрессии мРНК для iNOS не снижался при стимуляции (26,02±2,22 % мРНК β-актина, по сравнению с 19,76±2,99 % мРНК β-актина для ДК). Существенные различия были обнаружены для активности аргиназы в зрелых дендритных клетках. Стимуляция клеток с ЛПС приводила к снижению активности аргиназы в дендритных клетках, полученных в отсутствии аденозинового аналога (3114±298,1 МЕ/10⁶клеток, по сравнению с 4916±603,7 МЕ/10⁶клеток в незрелых ДК, р=0,0367) . В то же время, в зрелых АДДК аргиназная активность существенно возрастала до значений 10802±1299 МЕ/10⁶клеток (по сравнению с незрелыми АДДК 6471±504,6 МЕ/10⁶, р=0,02). То есть наблюдалась обратная тенеденция по отношению к физиологическому созреванию. Таким образом в АДДК мы обнаружили повышение активности аргиназы с одновременным сниженнием уровня активности NO-синтазы. В тоже время уровень экспрессии мРНК для iNOS не снижался. Одним из механизмов этого эффекта может быть регуляция трансляции iNOS концентрацией аргинина. Снижение концентрации внеклеточного аргинина, за счет усиленной работы аргиназы, активирует сигнальный каскад внутри клеток приводящий к ограничению трансляции белка iNOS. [3]

Заключение: на основании проведенных исследований мы сделали заключение о том, что аденозин приводит к снижению способности зрелых дендритных клеток индуцировать Т клеточный иммунный ответ. Одним из механизмов, лежащих в основе пониженной функциональной активности АДДК, вероятно является увеличение активности аргиназы.

Работа выполнена при поддержке ФЦП 1.5, госконтракт № 02.740.11.5150