Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Кафедра фундаментальных основ клинической медицины, НОЦ молекулярной медицины
Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 70-й Юбилейной итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 16-18 мая 2011 г.), под ред. В. В. Новицкого, Л. М. Огородовой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2011. − 430 с.
Актуальность: апоптоз является формой программированной гибели клетки основной функцией, которого является поддержание клеточного гомеостаза и удаления генетически дефектных клеток в организме. Исследование различных путей регуляции апоптоза способствуют более глубокому и полному пониманию молекулярных механизмов формирования различных патологических состояний, что, в свою очередь, необходимо для разработки новых подходов к лечению [Ярилин А.А., 2003].
Одним из основных механизмов реализации апоптоза является рецептор-опосредованнный путь, важную роль в котором играет система TNF, включающая многофункциональный цитокин – TNF-α, мембранно-локализованный рецептор TNF-R1 и конкурирующий за связывание с лигандом растворимая форма TNF-R1 (sTNF-R1) [Ковальчук Л. В. и соавт., 2001]. В качестве индукторов апоптоза могут выступать цитокины, колониестимулирующие факторы, ростовые пептиды и гормоны. Кроме физиологических сигнальных молекул, запускающих программу гибели клетки, могут быть использованы их синтетические аналоги, так дексаметазон (глюкокортикостероид) инициирует апоптоз за счет активации каспаз-8 и 3.
Другим немаловажными участниками программированной гибели клетки являются белки теплового шока (heat shock protein – Hsp) являющиеся молекулярными шаперонами. Одним из представителей Hsp является белок теплового шока 90кДа (Hsp90), который блокирует пути активации апоптотической гибели, стабилизируя клеточные структуры. Известно, что опухолевые клетки синтезируют повышенное количество Hsp90, что предохраняет их от запуска апоптоза в ответ на стрессорные воздействия, а снижение синтеза Hsp в опухолях облегчает индукцию апоптоза и понижает их способность к прогрессированию [Мельников Э.Э., Ротанова Т.В., 2010].
Исследования молекулярных взаимоотношений Hsp90, дексаметазона и системы TNF является актуальной задачей медико-биологической науки, так как имеющиеся данные в этой области малочисленны и противоречивы.
Цель: оценить влияние белка теплового шока 90кДа и дексаметазона на систему TNF (TNF-α, TNF-R1, sTNF-R1) в опухолевых клетках линии Jurkat.
Материал и методы: в качестве материала исследования была использованы опухолевая клеточная линия Jurkat (острый T–лимфобластный лейкоз), полученная из Российской коллекции клеточных культур института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) и мононуклеарные лейкоциты, выделенные из венозной крови здоровых доноров.
Опухолевые клетки и мононуклеарные лейкоциты здоровых доноров культивировали в полной питательной среде при 37°C в атмосфере 5% CO2. Выделение мононуклеаных лейкоцитов осуществляли в градиенте плотности фикола («Sigma», США). Клетки инкубировали в среде с добавлением индуктора апоптоза - дексаметазона (10мкМ), ингибитора Hsp90 (17-AAG в концентрации 5мкМ) и в сочетании 5 мкМ 17-AAG и 10мкМ дексаметазона в течение 18 часов in vitro. Апоптотическую гибель клеток оценивали методом флуоресцентной микроскопии с помощью FITC-меченного аннексина V и пропидий иодида («Beckman Coulter», США). Для определения количества мононуклеарных лейкоцитов, несущих рецептор к TNF-α (TNF-R1) использовали метод проточной цитофлуориметрии («Beckam Coulter», Франция). Определение уровня TNF-α («BioSource», США) и растворимой формы рецептора sTNF-R1 («BioSource», США) оценивалось методом иммуноферментного анализа. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы SPSS 11.5.
Результаты: при оценке числа опухолевых клеток и лейкоцитов здоровых доноров, вступивших в апоптоз, в культурах при добавлении 17-AAG, дексаметазона и при их совместном действии (р<0,05) было получено достоверное увеличение данного параметра по отношению к интактным клеткам. Помимо этого контрольная группа линии Jurkat показала большую устойчивость к апоптотической гибели, чем мононуклеарные клетки здоровых доноров. Анализ продукции TNF-α не выявил значимых различий (р>0,05) между исследуемыми группами в опухолевых клетках, а у здоровых доноров наблюдалось снижение концентрации данного цитокина при культивировании с 17-AAG (р<0,05). При добавлении селективного ингибитора Hsp90 наблюдалось повышение экспрессии TNF-R1 в контрольных группах опухолевых клеток и мононуклерах здоровых доноров (р<0,05). Продукция растворимой формы рецептора TNF-R1 в мононуклеаных лейкоцитах уменьшалась (р<0,05) при добавлении 17-AAG, дексаметазона и при их совместном действии. Уровень sTNF-R1 в опухолевой культуре достоверно снижался (p<0,05) при инкубировании клеток с дексаметазоном и при ингибировании Hsp90 по отношению к контролю.
Таким образом, белок теплового шока 90кДа в опухолевых клетках линии Jurkat повышает продукцию sTNF-R1 и не влияет на TNF-α. Ингибировагние Hsp90 in vitro в культуре Jurkat приводит к усилению апоптотического действия дексаметазона и увеличению экспрессии TNF-R1.
Список литературы:
1. Ярилин, А. А. Апоптоз и его роль в целостном организме / А. А. Ярилин // Глаукома. – 2003. - № 2. – С. 46-54.
2. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа : учебно-методическое пособие / Л. В. Ковальчук, Л. В. Гонковская, М. В. Хорева, Е. В. Соколова. – М., 2001. – 158 с.
3. Мельников, Э. Э. Молекулярные шапероны / Э. Э. Мельников, Т. В. Ротанова // Биоорганическая химия. – 2010. - Т. 36, № 1. - С. 5-14.
|
