|
ГОУВПО СибГМУРосздрава (г. Томск)
Эта работа опубликована в сборнике "Науки о человеке": материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М.
Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2008. – 135 с.
Посмотреть обложку сборника
Скачать сборник целиком
Одними из важнейших элементов системы окислительно-восстановительного баланса клеток являются активные формы кислорода (АФК). Они могут быть не только основным патогенетическим звеном сердечно-сосудистых заболеваний, бронхиальной астмы, сахарного диабета, опухолевых процессов и др. [2], но и регулировать различные сигнальные каскады, включая кальциевую сигнализацию, протеинкиназные и протеинфосфатазные пути [3]. В последнее время все больше появляется сведений о том, что деполимеризация белков цито-скелета, активно участвующая в сократительной активности гладкомышечных клеток (ГМК), является начальным этапом повреждения клеток, вызванного оксидативным стрессом [4]. Тем не менее, влияние перекиси водорода на цитоскелет-зависимую сократительную активность ГМК сосудов практически не исследовалось.
Целью исследования явилось изучение вклада перекиси водорода и элементов цитоскеле-та в механизмы регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток аорты крысы.
Объектами исследования служили интактные и деэндотелизированные гладкомышечные сегменты аорты беспородных белых крыс. Для исследования сократительной активности ГМК использовали метод механографии. Жизнеспособность ГМК поддерживалась непрерывной перфузией препарата физиологическим раствором Кребса ( NaCl - 120.4 мМоль/л; KCl - 5.9 мМоль/л; MgCl2 - 1.2 мМоль/л; CaCl2 - 2.5 мМоль/л; трис-(оксиметил)-аминометан - 15.5 мМоль/л; глюкоза - 11.5 мМоль/л), в растворе поддерживалась температура 36.5 - 37.5 0С и pH - 7.35. Тестирующие растворы готовились путем добавления в раствор Кребса соответствующих реактивов: тетраэтиламмония хлорида (Serva), аминотриазола (Wako), перекиси водорода (Россия), колхицина и фенилэфрина (Sigma). Амплитуда сократительных ответов гладкомышечных сегментов рассчитывалось в процентах от амплитуды контрольного гиперкалиевого (эквимолярное замещение 30 мM NaCl на KCl) сокращения. В ряде экспериментов амплитуду сократительных ответов рассчитывали в процентах от амплитуды сокращения, активируемого фенилэфрином (10 мкМ).
Результаты представлены как среднее арифметическое ± среднеквадратичное отклонение (о) и обработаны с помощью программного пакета Statistika с использованием непараметрического критерия Мана-Уитни. Достоверными считали различия при значении р<0.05.
Для исследования влияния перекиси водорода (1-500 мкМ) на сокращения вызванные деполяризацией мембраны сосудистых гладкомышечных сегментов воздействовали гиперкалиевыми растворами (30,60 и 120 мМ KCl). В ответ на эквимолярное замещение 30 (60, 120) мМ NaCl на KCl регистрировались сокращения сегментов аорты. Величина сокращения сегмента в растворе, содержащем 30 мМ KCl принята за 100%. Амплитуда сокращений при действии 60 и 120 мМ KCl составила 129±6.8% и 145±13.6% (n=5, р<0.05), соответственно. Перекись водорода (500 мкМ) вызывала дополнительное увеличение механического напряжения (МН) сегментов, предсокращенных гиперкалиевыми растворами (30, 60 и 120 мМ KCl) на 25.2±3.8%, 20.8 ±5.7% и 19.2±5.3% (n=5, р<0.05), соответственно, от контрольных значений. Эффекты перекиси водорода не зависели от наличия эндотелия.
Для исследования влияния перекиси водорода на изменения МН сосудистых ГМК, вызванные стимуляцией а1-адренэргических рецепторов, применяли фенилэфрин. Амплитуда сокращений в ответ на добавление 10 мкМ фенилэфрина в раствор Кребса была сравнима с действием 30 мМ KCl, но после действия перекиси водорода (500 мкМ) снижалась на 51.7±2.9% (п=7, р<0.05) от контрольных значений (рис. 1 А,Б).
Рисунок 1. Влияние перекиси водорода на амплитуду сокращений гладкомышечных сегментов аорты крысы, индуцированных гиперкалиевым раствором А и В, фенилэфрином Б и Г; В и Г воздействие констрикторных факторов в присутствии колхицина.
По оси ординат - механическое напряжение в мН, по оси абсцисс - время (часы). Стрелками показано добавление и удаление воздействующих факторов в раствор Кребса.
Для изучения влияния перекиси водорода на фармако-механическое сокращение в ГМК аорты крысы, фенилэфрин добавлялся на фоне действия раствора, содержащего 120 мМ KCl. Фенилэфрин (10 мкМ) на фоне 120 мМ KCl вызывал повышение МН до 197±19.8 (n=7, р<0.05) от контрольных значений. В этих условиях перекись водорода (500 мкМ) не влияла на величину МН гладкомышечных сегментов. Полученные данные указывают на то, что расслабляющие эффекты перекиси водорода на гладкие мышцы, предсокращенные фенилэфри-ном, не связаны с угнетением рецепторуправляемого входа ионов кальция в ГМК.
Внутриклеточная концентрация перекиси водорода зависит от активности расщепляющих ее ферментов, в том числе - каталазы. Ингибитор каталазы напряжения, и не влиял на сократительные эффекты гиперкалиевых растворов (30 мМ KCl) и перекиси водорода. Однако, если на фоне действия аминотриазола контрольное гиперкалиевое сокращение (100%) сохранялось, то фенилэфрин-индуцируемое - практически не развивалось, составляя 12.3±2.1% (n=6, р<0.05) от контроля.
Добавление 10 мкМ тетраэтиламмония (ТЭА) в раствор Кребса не влияло на исходный уровень механического напряжения ГМК, амплитуду гиперкалиевого (30 мМ KCl) сокращения, но вызывало увеличение амплитуды фенилэфрин-индуцируемого сокращения (10 мкМ) на 11.4±7.2% (n=6, р<0.05). В условиях угнетения калиевой проводимости мембраны ТЭА, релаксирующий эффект перекиси водорода (500 мкМ) на фоне действия фенилэфрина сохранялся, как и её активирующее действие на вызванное гиперкалиевым раствором МН сегментов аорты крысы.
Для выявления участия цитоскелета в сократительных реакциях гладких мышц на действие перекиси водорода использовали дезинтегратор цитоскелета колхицин. На фоне действия колхицина (10мкМ, 90минут) амплитуда гиперкалиевых сокращений (30 мМ KCl) сосудистых сегментов снизилась до 82.9±12.7% (n=9, р<0.05) от контрольных значений. В присутствии колхицина активирующее влияние перекиси водорода на сокращение вызванное хлоридом калия статистически значимо не изменилось, составляя 25.6±5.1% (n=8) по сравнению с контрольными значениями.
После предобработки гладких мышц колхицином амплитуда сокращений сосудистых сегментов, вызванных добавлением фенилэфрина, статистически значимо снижалась до 87.7±10.3% (n=6, р<0.05). При этом релаксирующее влияние перекиси водорода (500 мкМ) на сокращение, вызванное фенилэфрином, достоверно усилилось: амплитуда сокращений составила 16.5±4.1% (n=7, р<0.05) от контрольных значений (рис. 1 В,Г).
Ранее было показано, что в основном актиновые элементы цитоскелета вовлекаются в развитие фенилэфрин-индуцируемого сокращения гладких мышц[1]. Это дает основание предположить именно их участие в оперировании сигнальных путей включаемых стимуляцией а1-адренергических рецепторов. Потенцирование колхицином эффектов перекиси водорода сокращений ГМК аорты крысы, вызванных фенилэфрином, свидетельствует о вовлечении элементов цитоскелета в механизмы действия этой АФК. В отличие от этого, сокращения гладких мышц, индуцируемые гиперкалиевым раствором, и перекисью водорода в меньшей степени зависят от состояния цитоскелета.
Список литературы:
1. Гусакова, С.В. Исследование роли цитоскелета в регуляции сократительной активности гладкомышечных клеток аорты крысы / С.В. Гусакова // Бюллетень Сибирской медицины. - 2007. - 1. - С. 78-82.
2. Коляденко, В.Ф. Влияние гнотобиологической изоляции на состояние системы "Пе-рекисное окисление липидов - антиоксидантная активность" у детей с бронхиальной астмой / В.Ф. Коляденко, Ю.А. Царёва // Ж. Педиатрия. -2001. - № 1. - С. 26-28.
3. Thakali, K. Pleiotropic Effects of Hydrogen Peroxide in Arteries and Veins From Nor-motensive and Hypertensive Rats / K. Thakali, L. Davenport; G. D. Fink. // J. Hypertension. - 2006. - V 47. - P. 482-493.
4. Valen, G. Hydrogen peroxide induces endothelial cell atypia and cytoskeleton depoly-merization / G. Valen, A. Sonden, J. Vaage. // Free Radical Biology and Medicine. -1999. - V. 26, - N. 11. - P. 1480 - 1488.
5. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ, контракты № 08-0499037, № 07-04-01184
|
