Бобрышев Ю.В., Карагодин В.П., Ковалевская Ж.И., Шапырина Е.В., Каргаполова Ю.М., Галактионова Д.Ю., Салямов В.И., Орехов А.Н.

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН (г. Москва), ГОУ ВПО Пущинский государственный университет (г. Москва).

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Проблемы и перспективы современной науки" с материалами Четвертой Международной Телеконференции "Фундаментальные науки и практика" - Том 3 - №1. - Томск - 2011.

РЕЗЮМЕ

Повышенная пролиферация клеток на ранних этапах атеросклеротического поражения считается важным этапом развития этой патологии, но степень пролиферации на разных стадиях образования атеросклеротической бляшки в различных больших артериях человека изучена до сих пор недостаточно. В настоящей работе исследованы толщина интимы и пролиферация вновь «инфильтрованных» гематогенных и оседлых (резидентных) клеток при атеросклеротическом поражении сонных и коронарных артерий и проведено сравнение с аналогичными результатами, полученными на аорте и представленными нами в более ранних публикациях. Анализ толщины интимы и пролиферации в нормальной интиме и при различных стадиях атеросклеротического поражения (начальные стадии, липидные полосы, липофиброзные бляшки, фиброзные бляшки) обнаружил, что, несмотря на наличие аналогичных тенденций в изменении уровня инфильтрации гематогенных клеток и пролиферации в разных типах артерий, существуют значительные количественные отличия между разными типами артерий.  В частности, обнаружено, что гематогенные клетки в липофиброзных бляшках коронарных и сонных артерий составляют треть и почти половину общей клеточной популяции, соответственно, тогда как пораженные атеросклерозом участки аорты, как показано нами ранее, содержат не более чем 15% гематогенных клеток. Это позволяет считать, что вклад кроветворных клеток в развитие атеросклероза в сонных и коронарных артериях более весом, чем в аорте. Несмотря на различия в числе накапливающихся кроветворных клеток в интиме, аналогичная колоколообразная зависимость числа клеток от типа поражения (в последовательности нормальная интима-начальные стадии патологии-липидные полосы-липофиброзные бляшки, фиброзные бляшки) была показана для коронарных и сонных артерий. Визуализация пролиферирующих клеток (PCNA-позитивных) в атеросклеротических и нормальных (неизмененных) зонах коронарных и сонных артерий выявило сходную картину. Максимальное число PCNA-позитивных резидентных клеток обнаружено в липофиброзных бляшках. Изменения общего количества клеток сопровождались изменениями как пролиферирующих резидентных (оседлых) клеток, так и пролиферирующих гематогенных клеток.

ВВЕДЕНИЕ

Развитие атеросклероза в главных артериях приводит к серьезным, зачастую губительным последствиям. Повышенная пролиферация клеток в атеросклеротической бляшке рассматривается как важнейшее событие этого патогенеза. Многие исследователи сообщили о присутствии пролиферирующих клеток в аорте человека и артериях других типов. Ранее мы продемонстрировали, что образование фокальных утолщений интимы в аорте человека, которое представляет первое структурное изменение, связанное с развитием атеросклероза, сопровождается увеличением общего числа клеток и количества пролиферирующих клеток [7,10]. Хотя пролиферация клеток в интиме артерий, как представляется, играет важную роль в развитии атеросклероза [1], остается неизвестным, сходна ли пролиферация в разных типах главных артерий человека. В настоящей работе исследована активность пролиферации и численность клеток при разных типах атеросклеротического поражения в сонных и коронарных артериях.  Мы также делаем попытку сравнить параметры клеточного состава и пролиферации сонных и коронарных артерий с аналогичными показателями аорты, представленными в наших ранних публикациях [7,10]. Мы считаем, что данная публикация впервые представляет фактические сведения о сходстве и различии клеточного состава и пролиферации в разных типах больших артерий, для которых развитие атеросклероза является исключительно важным.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

            Аутопсийный материал. Правая коронарная артерия и правая сонная артерия ниже точки бифуркации были извлечены через 1,5-3 часа после неожиданной смерти у 29 мужчин и женщин в возрасте 23-70 лет. Артерии были вскрыты продольно длине и промыты изотоническим фосфатным буфером (ИФБ) с pH 7.6. Внешне непораженные участки артерий (диффузное утолщение интимы) и участки с атеросклеротическими поражениями идентифицировали макроскопически, а затем микроскопически в соответствии с классификацией Совета по атеросклерозу Американского Общества по изучению сердца [11, 12].

Внешне неизмененные участки аорты имели гладкую люминальную поверхность. Участки интимы с начальными поражениями представляли собой части артерий с гладкой желтоватой поверхностью, иногда с мелкими желтыми точками. Наблюдались небольшие скопления внеклеточных липидных капель в соединительно-тканном  матриксе. Помимо оседлых клеток, в участках начальных поражений можно было обнаружить увеличенное по сравнению с внешне неизмененной интимой количество мононуклеарных клеток. Никаких других нарушений в структуре ткани не выявлялось. Жировые полосы (поражения II типа) представляли собой полоски и точки желтого цвета, немного выступающие над поверхностью сосуда. Часто можно было обнаружить жировые полоски, слившиеся между собой в более крупные структуры (кластеры). На срезах ткани липиды выявлялись в основном внутриклеточно, как в гладкомышечных клетках, так и в макрофагах. В соединительнотканном матриксе иногда обнаруживались внеклеточные липиды.

Липофиброзные бляшки (поражения  Vа типа) выглядели как сильно выступающие над люминальной поверхностью желтоватые или перламутровые круглые или эллипсоидные образования. Микроскопически в этих поражениях обнаруживались все изменения характерные для жировых полос: накопление внутриклеточных липидов, разрастание внеклеточного матрикса.  Кроме этого, в липофиброзных бляшках выявлялось массивное некротическое ядро и расположенная над ним соединительнотканная покрышка, имелись участки, по морфологии похожие на жировые полосы.

Фиброзные бляшки (поражения  Vс типа) представляли собой сильно приподнятые жемчужного цвета округлые или овальные образования, состоящие в основном из грубого соединительнотканного матрикса, с «замурованными» в нем клетками. Липидный компонент был минимальным или отсутствовал. 

Для анализа отбирали участки артерий с наиболее выраженными признаками атеросклеротического поражения, встречающиеся наиболее часто.

После макроскопической идентификации из внешне непораженных и атеросклеротических участков (начальные поражения, жировые полосы, липофиброзные и фиброзные бляшки) вырезали кусочки 5Х10 мм2 перпендикулярно длинной оси сосуда для вертикальных срезов. Образцы помещали в матричную среду (пластиковые формочки) O.C.T. Compound (Miles Inc., Elkhart, IN, USA), замораживали в жидком азоте и использовали для приготовления вертикальной секции. Впоследствии получали 5 мкм криостатные секции, которые окрашивали гематоксилин-эозином в соответствии со стандартным протоколом для микроскопического анализа, цитохимической идентификации эластина и иммуноцитохимического изучения.

Иммуноцитохимический и микроскопический анализы выполнялись как описано ранее [7,10,13,14]. Типы клеток (гладкомышечные клетки, клетки эндотелия, макрофаги, Т- и В-клетки) идентифицировали с использованием специфичных к ним антител-маркеров.

Морфометрический анализ проводили следующим образом. Толщину интимы артерий определяли в вертикальных секциях с использованием окулярного микрометра. Результаты иммуноцитохимических  измерений с использованием разных антигенов подвергались компьютерному анализу (программа NIH Image PC image-analyzing). Общее количество клеток определяли по количеству ядер. Число положительно окрашенных клеток определяли по числу ядер, ассоциированных с положительно окрашенной цитоплазмой. Морфометрические данные включали: 1/процент положительно окрашенных клеток от их общего числа; 2/число положительно окрашенных клеток в участке среза, захватывающем всю глубину среза (от эндотелия до внутренней эластической мембраны) с шириной 1 мм вдоль люминальной поверхности. Используя эти параметры, сравнивали непораженные участки аорты и участки с атеросклеротическими поражениями. Количество гематогенных клеток определяли, используя смесь антител против   CD14 и CD45 антигенов. Клетки, отрицательные по отношению к CD14 и CD45, считались оседлыми. Значимость различий между группами средних величин оценивали с помощью SPSS пакета статистических программ.

Небольшие кусочки ткани из сонных и коронарных артерий фиксировались в 1% растворе глютаральдегида (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) в фосфатном буфере (PBS). Электронная микроскопия применялась в соответствии с процедурами, описанными нами ранее [13,14].

РЕЗУЛЬТАТЫ

            Сравнительный анализ толщины интимы в сонных и коронарных артериях. В опытах проведено сравнение толщины интимы в нормальных (или диффузно-утолщенных) и атеросклеротических зонах, соответствующих начальной стадии поражения (I), жировым полосам (II), липофиброзным  бляшкам (Vа), фиброзным бляшкам (Vс). Эти типы повреждений были использованы для анализа как наиболее часто встречающиеся и характерные этапы развития атеросклероза. Толщина интимы в нормальных зонах коронарных артерий была примерно в 2 раза больше, чем в аналогичных зонах сонных артерий. Максимальная толщина наблюдалась в атеросклеротических бляшках пораженных зон (Vа и Vс поражения). Различие в толщине атеросклеротических бляшек сонных и коронарных артерий было статистически незначимым.

Состав клеток и количественное определение вновь инфильтрованных (гематогенных) и резидентных клеток интимы. Иммуногистохимические данные указывают на то, что нормальная интима состоит главным образом из α actin+клеток гладкой мускулатуры и отделена от просвета клетками эндотелия (von Willebrand factor+клетками). Только небольшое количество макрофагов и лимфоцитов было обнаружено в артериальной стенке сонных и коронарных артерий, тогда как макрофаги и Т-клетки часто наблюдались в атеросклеротических участках. В таких участках, содержащих воспалительные инфильтраты, также присутствовали В-клетки. С помощью электронной микроскопии выявлены отличительные ультраструктурные особенности идентифицированных типов клеток.

Принято считать, что толщина интимы зависит от числа составляющих ее клеток и их метаболической активности [1]. В этой связи представлял интерес ответ на вопрос: каково взаимоотношение между толщиной интимы и количеством субэндотелиальных клеток (интимацитов) при разных типах атеросклеротического поражения? В нашем исследовании определено число клеток в разных зонах, включая все клеточные слои от эндотелия до внутренней эластичной мембраны в пределах секции шириной в 1 мм, обращенной к поверхности просвета артерии. Количество интимацитов в нормальной интиме коронарных и сонных артерий составляло 360 и 270 клеток на миллиметр, соответственно.

Таким образом, обнаружено увеличение количества клеток интимы в атеросклеротических бляшках артерий обоих типов. Количественный анализ указывает на «колоколообразную» корреляцию между числом клеток и типом поражения в следующем ряду: нормальная интима-начальные стадии патологии-липидные полосы-липофиброзные бляшки - фиброзные бляшки. Максимальное число клеток было обнаружено в липофиброзных бляшках (Vа). В сосудах всех типов общее число клеток в фиброзных бляшках было меньше, чем в липофиброзных бляшках. Увеличение числа интимацитов может объясняться как возросшей «инфильтрацией» клеток, циркулирующих в крови, к поврежденным участкам, так и нарастанием числа оседлых клеток. Для того, чтобы оценить относительный вклад каждой из этих двух популяций в рост численности клеток в пораженных участках артерий, мы определили количество оседлых и вновь инфильтрованных (гематогенных) клеток в интиме сонных и коронарных артерий. Для этого была использована смесь антител против С45 и С14 антигенов, что дало возможность идентифицировать все типы гематогенных клеток, включая Т- и В-клетки, лимфоциты, полиморфоядерные лейкоциты и моноциты/макрофаги.

Клетки, негативные по отношению к антигенам CD45/CD14, рассматривались как представители популяции оседлых клеток. По аналогии с общем количеством клеток, число оседлых и гематогенных клеток обнаружило колоколообразную зависимость от типа поражения в следующем ряду: непораженная интима-начальные стадии поражения-жировые полосы-липофиброзные бляшки-фиброзные бляшки. Число оседлых клеток было значительно выше, чем число вновь инфильтрованных клеток как в сонных, так и в коронарных артериях при поражениях всех типов, исключая  Va в сонных артериях (недостоверное различие). Максимальное количество гематогенных клеток было обнаружено в липофиброзных бляшках. Число оседлых клеток в пораженных зонах сонных артерий достигло своего максимума липофиброзных бляшках (поражение типа Va). В коронарных артериях, однако, максимальное количество оседлых клеток достигалось в жиpовых полосах (поражение типа II). Число клеток в фиброзных бляшках было меньше, чем в липофиброзных, в сосудах обоих типов. Наиболее сильное возрастание числа инфильтрующих интиму гематогенных клеток  наблюдалось в липофиброзных бляшках коронарных и сонных артерий. В дополнение к увеличению общего количества клеток, липофиброзные бляшки характеризовались существенным возрастанием доли гематогенных клеток в клеточной популяции интимы (табл. 1).

Таблица 1. Доля воспалительных клеток в артериях человека, %

* - статистически значимое отличие по сравнению с непораженной интимой с p<0.05. Число проанализированных событий указано в скобках.

Количество пролиферирующих клеток увеличивается в атеросклеротических бляшках. Полученные данные указывают на то, что возрастание числа гематогенных и оседлых клеток может быть вызвано увеличением клеточной миграции или пролиферацией.  Для того, чтобы оценить вклад пролиферации в это возрастание, мы подсчитывали делящиеся клетки, позитивные к антигену делящегося клеточного ядра (PCNA) как маркеру S фазы. Электронная микроскопия позволила идентифицировать интимациты на стадии метафазы. Во всех проанализированных сосудах мы наблюдали возрастание количества пролиферирующих клеток (PCNA+) в зонах поражения по сравнению с непораженной интимой.

Максимальное количество PCNA-положительных клеток было обнаружено в липофиброзных бляшках как сонных, так и коронарных артерий. Число PCNA-положительных клеток в жировых полосах превышало аналогичную величину для нормальной интимы в сонных артериях в 9 раз, а коронарных артериях – в 7 раз. В липофиброзных бляшках число   PCNA-положительных клеток увеличилось в 30 раз в сонных артериях и в 20 раз в коронарных артериях по сравнению с нормальной интимой. Общее количество пролиферирующих клеток в фиброзных бляшках было значительно меньше, чем в липофиброзных. Профиль изменений количества  PCNA-положительных клеток соответствует профилю числа вновь инфильтрованных гематогенных клеток и оседлых клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличение общего числа клеток в пораженных атеросклерозом тканях обусловлено пролиферацией клеток.

В дополнение к количественному определению общего количества делящихся клеток, мы анализировали изменения в индексе пролиферации  популяций гематогенных и оседлых клеток. Этот индекс был определен как процент  PCNA-положительных клеток от клеточной субпопуляции, идентифицированной с помощью CD14/CD45 окрашивания. Индекс пролиферации гематогенных клеток был значительно выше во всех зонах интимы по сравнению с аналогичной величиной для оседлых клеток (табл. 2).

Таблица 2. Индекс PCNA-положительных клеток в артериях человека

* - статистически значимое отличие по сравнению с непораженной интимой с p<0.05.

Число проанализированных событий указано в скобках.

При атеросклеротическом поражении сонных и коронарных артерий индекс пролиферации гематогенных клеток снижался по сравнению с нормальной интимой. Индекс пролиферации оседлых клеток изменялся в зависимости от вида сосудов и типа поражения. В коронарных артериях индекс пролиферации оседлых клеток был выше при всех типах поражения по сравнению с непораженной интимой (табл. 2). В сонных артериях, однако,  индекс пролиферации оседлых клеток увеличивался только в жировых полосах и липофиброзных бляшках по сравнению с непораженной интимой. Как в сонных, так и в коронарных артериях максимальное значение индекса пролиферации наблюдалось в липофиброзных бляшках. В фиброзных бляшках индекс пролиферации оседлых клеток коронарных и сонных артерий снижался почти до нормального уровня.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что локальные утолщения интимы как одно из главных проявлений атеросклероза сопровождаются увеличением числа клеток в аорте человека [3,7,8,10,13,15]. Было показано, что в зонах атеросклеротического поражения интимы аорты человека количество пролиферирующих клеток нарастает, обусловливая и рост общей численности клеток [7]. Сравнение изменений, ранее описанных нами для атеросклеротических поражений аорты, с изменениями в коронарных и сонных артериях указывают на общую закономерность – существенное утолщение пораженных зон.

При сходстве общей картины, наблюдаются, тем не менее, достаточно важные различия. Абсолютная толщина непораженной интимы аорты человека значительно превосходит толщину коронарной и сонной артерии. Однако толщина бляшки аорты практически такая же, как у коронарной и сонной артерий. Хотя аорта значительно больше, чем коронарная и сонная артерии, толщина атеросклеротической бляшки не зависит от типа артерий, их диаметра  и исходной (базальной) толщины интимы в непораженных зонах сосудов. Эта данные указывают на сходство процессов образования бляшки в артериях разных типов.

Утолщение интимы сонных и коронарных артерий сопровождается накоплением гематогенных клеток. Для визуального наблюдения за ними используется смесь антител против CD45, антигена, свойственного для лейкоцитов, и антител CD14 против моноцитов и макрофагов. Максимальное количество гематогенных клеток обнаружено в липофиброзных бляшках. Вклад гематогенных клеток в развитие атеросклероза в сонных и коронарных артериях более значителен, чем в аорте.

По аналогии с аортой [7,10], количество клеток в липофиброзных бляшках коронарных и сонных артерий было значительно выше, чем в непораженных зонах. Эти изменения сопровождались увеличением числа оседлых и гематогенных клеток. Как и в аорте [7], в коронарных и сонных артериях наблюдалась колоколобразная зависимость количества клеток от степени поражения. Наблюдение за делящимися клетками (PCNA-положительными) в пораженных и непораженных зонах было сходно в аорте [7], с одной стороны, и в коронарных и сонных артериях – с другой. Максимальное число PCNA-положительных оседлых клеток наблюдалось в липофиброзных бляшках. Изменения общего числа клеток сопровождались изменениями как в пролиферирующих оседлых клетках, так и пролиферирующих гематогенных клетках. Полученныe данные подтверждают точку зрения о принципиальной схожести клеточных механизмов развития атеросклероза и сосудах разных типов.

Можно предположить, что пролиферация гематогенных (воспалительных) клеток отвечает за увеличение числа клеток интимы. Однако это вряд ли единственная причина связанного с атеросклерозом возрастания количества клеток, так как индекс пролиферации гематогенных клеток в зонах атеросклеротического поражения сонных и коронарных артерий был ниже нормального значения. Таким образом, пролиферативная активность гематогенных клеток остается неизменной во время развития атеросклероза вплоть до последних стадий. Оседлые клетки, напротив, демонстрировали изменения индекса пролиферации. Вероятно, пролиферативная активность гематогенных клеток не влияет на общее количество клеток в пораженных сосудах. Представляется, что изменение числа гематогенных клеток, наблюдаемое в пораженных зонах, происходит за счет их миграции из кровотока, а не является результатом клеточного деления в интиме.

Накопление гематогенных клеток в зонах атеросклеротического поражения может являться результатом трансфера иммунных клеток из крови в интиму [16-21]. Важно указать на то, что такое накопление коррелирует с аккумуляцией липидов и интиме артерий [22, 23]. Максимальное количество гематогенных клеток было обнаружено в зонах атеросклеротического поражения с самым высоким уровнем содержания липидов [22, 23]. Хорошо известно, что накопление липидов в стенке сосуда обусловлено инфильтрацией в интиму модифицированных ЛНП [1]. Модификация ЛНП также создает предпосылки для воспаления [1,2, 16]. Воспаление опосредовано иммунными реакциями. Как адаптивный, так и врожденный  иммунитет стимулируется модифицированными ЛНП [2, 16, 24]. Обнаружено, что модифицированные ЛНП, присутствующие в зонах поражения, запускают образование антител [25, 26]. Роль антиген-специфичного клеточного иммунитета изучалась в модельных экспериментах на мышах, и полученные данные прямо указывают на то, что клеточный иммунный ответ на частицы модифицированных ЛНП сопровождается  сильной атерогенностью [1, 16, 24].

Как результат стимулирования иммунитета, воспалительные клетки проникают в зону поражения [16-21]. Провоспалительные цитокины и хемокины, секретируемые проникшими иммунными клетками, могут стимулировать пролиферацию оседлых клеток интимы. Именно этим, как представляется,  обусловлен параллелизм в изменениях индекса пролиферации оседлых клеток и числе гематогенных клеток, обнаруженный нами в зонах поражения. Однако, механизм стимулирования пролиферации резидентных клеток за счет проникновения иммунных клеток не является единственным объяснением пролиферативного «всплеска» в обогащенных липидами зонах атеросклеротического поражения. Изменения в индексе пролиферации оседлых клеток также соответствуют изменениям в содержании липидов в артериальной интиме.

Ранее мы обнаружили повышенную клеточную пролиферацию в первичной культуре клеток, выделенных из зон атеросклеротического поражения аорты человека [22, 27]. Мы показали, что добавление модифицированных ЛНП к первичной культуре субэндотелиальных клеток стимулирует клеточное деление [22, 23, 27]. Ясно, что в культуре клеток проникновение воспалительных клеток не происходит. Следовательно, можно ожидать, что проникновение воспалительных клеток не является sine qua non для стимулирования пролиферации оседлых клеток в интиме. В ряде работ показано, что модифицированные ЛНП стимулируют пролиферацию в гомогенных культурах клеток гладкой мускулатуры в отсутствие воспалительных клеток [28-30]. Таким образом, мы полагаем, что изменения пролиферативной активности оседлых клеток интимы могут быть вызваны прямым действием модифицированных ЛНП даже без вовлечения в этот процесс воспалительных клеток.

С учетом всей совокупности имеющихся данных, можно полагать, что увеличение толщины интимы, обнаруживаемое в артериях человека, сопровождается возрастанием пролиферативной активности оседлых клеток. В сонных и коронарных артериях наблюдается также увеличение числа гематогенных клеток вследствие, надо думать, их миграции в зону поражения.

Атеросклероз может рассматриваться как воспалительное заболевание, которое включает активацию эндотелия, адгезию и инфильтрацию нескольких типов иммунных клеток, включая иммуноциты и Т-клетки, дифференциацию вновь инфильтрованных моноцитов в макрофаги и пролиферацию как оседлых клеток, так и вновь прибывших иммунных клеток гематогенного происхождения [2, 16]. Вклад клеточной пролиферации в утолщение интимы остается спорным вопросом, так как один из главных проатерогенных цитокинов, имеющих Т-клеточное происхождение (IFN-gamma), обладает выраженным антипролиферативным действием [2,16]. Хотя считается, что возросшее число гематогенных клеток в атеросклеротической бляшке может представлять дестабилизирующий ее фактор, который ведет к разрыву бляшки, тромбозу и другим осложнениям [1, 2, 16], механизмы, с помощью которых гематогенные клетки вызывают дестабилизацию бляшки, до сих пор недостаточно понятны [1, 2, 16].

Настоящая работа предоставляет фактические сведения об особенностях клеточного состава и пролиферации в разных типах больших артерий и, таким образом, способствует уточнению соотношения действия клеточной инфильтрации и пролиферации на пораженные зоны при развитии атеросклероза.

Работа была поддержана Министерством образования и науки РФ.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Ross R. Atherosclerosis - an inflammatory disease. N Engl J Med 1999; 340:115-26.

[2] Hansson GK. Atherosclerosis - an immune disease: The Anitschkov Lecture 2007. Atherosclerosis 2009;202:2-10.

[3] Orekhov AN, Andreeva ER, Krushinsky AV, Novikov ID, Tertov VV, Nestaiko GV, Khashimov KA, Repin VS, Smirnov VN. Intimal cells and atherosclerosis. Relationship between the number of intimal cells and major manifestations of atherosclerosis in the human aorta. Am J Pathol 1986;125:402-15.

[4] Gordon D, Schwartz SM, Benditt EP, Wilcox JN. Growth factors and cell proliferation in human atherosclerosis. Transplant Proc 1989;21:3692-4.

[5] Rekhter MD, Gordon D. Cell proliferation and collagen synthesis are two independent events in human atherosclerotic plaques. J Vasc Res 1994;31:280-6.

[6] Rekhter MD, Gordon D. Active proliferation of different cell types, including lymphocytes, in human atherosclerotic plaques. Am J Pathol 1995;147:668-77.

[7] Orekhov AN, Andreeva ER, Mikhailova IA, Gordon D. Cell proliferation in normal and atherosclerotic human aorta: proliferative splash in lipid-rich lesions. Atherosclerosis 1998;139:41-8.

[8] Góis J, Higuchi M, Reis M, Diament J, Sousa J, Ramires J, Oliveira S. Infectious agents, inflammation, and growth factors: how do they interact in the progression or stabilization of mild human atherosclerotic lesions? Ann Vasc Surg 2006; 20:638-45.

[9] Hanke H, Lenz C, Finking G. The discovery of the pathophysiological aspects of atherosclerosis--a review. Acta Chir Belg 2001;101:162-9.

[10] Andreeva ER, Pugach IM, Orekhov AN. Collagen-synthesizing cells in initial and advanced atherosclerotic lesions of human aorta. Atherosclerosis 1997;130:133-42.

[11] Stary HC, Chandler AB, Glagov S, Guyton JR, Insull W Jr, Rosenfeld ME, Schaffer SA, Schwartz CJ, Wagner WD, Wissler RW. A definition of initial, fatty streak, and intermediate lesions of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association. Circulation 1994;89:2462-78.

[12] Stary HC, Chandler AB, Dinsmore RE, Fuster V, Glagov S, Insull W Jr, Rosenfeld ME, Schwartz CJ, Wagner WD, Wissler RW. A definition of advanced types of atherosclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association. Circulation 1995;92:1355-74.

[13] Babaev VR, Bobryshev YV, Sukhova GK, Kasantseva IA. Monocyte/macrophage accumulation and smooth muscle cell phenotypes in early atherosclerotic lesions of human aorta. Atherosclerosis1993;100:237-48.

[14] Bobryshev YV, Lord RS. Langhans cells of human arterial intima: uniform by stellate appearance but different by nature. Tissue Cell 1996;28:177-94.

[15] Pepine CJ, Nichols WW. Estrogen and different aspects of vascular disease in women and men. Circ Res 2006;99:459-61.

[16] Hansson GK: Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med 2005;352:1685-95.

[17] Bobryshev YV. Monocyte recruitment and foam cell formation in atherosclerosis. Micron 2006;37:208-22.

[18] Galkina E, Ley K. Leukocyte influx in atherosclerosis. Curr Drug Targets 2007;8:1239-48.

[19] Weber C, Zernecke A, Libby P. The multifaceted contributions of leukocyte subsets to atherosclerosis: lessons from mouse models. Nat Rev Immunol 2008;8:802-15.

[20] Galkina E, Ley K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis. Annu Rev Immunol 2009;27:165-97.

[21] Shimada K. Immune system and atherosclerotic disease. Heterogeneity of Leukocyte Subsets Participating in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Circ J 2009;73:994-1001.

[22] Tertov VV, Orekhov AN, Li Hwa Ryong, Smirnov VN. Intracellular cholesterol accumulation is accompanied by enhanced proliferative activity of human aortic intimal cells. Tissue Cell 1988;20:849-54.

[23] Orekhov AN, Tertov VV, Kudryashov SA, Smirnov VN. Triggerlike stimulation of cholesterol accumulation and DNA and extracellular matrix synthesis induced by atherogenic serum or low density lipoprotein in cultured cells. Circ Res 1990;66:311-20.

[24] Hartvigsen K, Chou MY, Hansen LF, Shaw PX, Tsimikas S, Binder CJ, Witztum JL. The role of innate immunity in atherogenesis. J Lipid Res 2009;50(Suppl):S388-93.

[25] Orekhov AN, Tertov VV, Kabakov AE, Adamova IYu, Pokrovsky SN, Smirnov VN. Autoantibodies against modified low density lipoprotein. Nonlipid factor of blood plasma that stimulates foam cell formation. Arterioscler Thromb 1991;11:316-26.

[26] Freigang S, Hörkkö S, Miller E, Witztum JL, Palinski W. Immunization of LDL receptor-deficient mice with homologous malondialdehyde-modified and native LDL reduces progression of atherosclerosis by mechanisms other than induction of high titers of antibodies to oxidative neoepitopes. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998;18:1972-82.

[27] Orekhov AN, Kosykh VA, Repin VS, Smirnov VN. Cell proliferation in normal and atherosclerotic human aorta. II. Autoradiographic observation on deoxyribonucleic acid synthesis in primary cell culture. Lab Invest 1983;48:749-54.

[28] Zhao GF, Seng JJ, Zhang H, She MP. Effects of oxidized low density lipoprotein on the growth of human artery smooth muscle cells. Chin Med J (Engl) 2005;118:1973-8.

[29] Ulrich-Merzenich G, Metzner C, Bhonde RR, Malsch G, Schiermeyer B, Vetter H. Simultaneous isolation of endothelial and smooth muscle cells from human umbilical artery or vein and their growth response to low-density lipoproteins. In Vitro Cell Dev Biol Anim 2002;38:265-72.

[30] Watanabe T, Pakala R, Katagiri T, Benedict CR. Mildly oxidized low-density lipoprotein acts synergistically with angiotensin II in inducing vascular smooth muscle cell proliferation. J Hypertens 2001;19:1065-73.