Авторы: М.А. Сазонова (1), М.М. Иванова (1,2), А.В. Желанкин (2), К.Ю. Митрофанов (2), З.Б. Хасанова (3), И.А. Собенин (1,2), В.А. Мясоедова (1,2), А.Ю. Постнов (3), А.Н. Орехов (1,2)

1Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук (г.Москва); 2Научно-исследовательский институт атеросклероза Российской академии естественных наук; 3 ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития России (г. Москва)

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Фундаментальные науки и практика" с материалами Третьей Международной Телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии" - Том 1 - №4. - Томск - 2010.

Резюме.
      Проведен анализ процента гетероплазмии мутации 652insG  митохондриального генома человека. Полученные результаты показывают значительную гетероплазмию данной мутации  не только между различными участками интимы аорты, но и между лейкоцитами крови больных атеросклерозом и здоровых доноров.
      Пороговый уровень гетероплазмии мутации митохондриального генома  652insG, равный 20%,  может служить прогностическим признаком атеросклероза сонных артерий у человека. 

Введение
      В России, как и в большинстве индустриальных стран, сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) занимают первое место в структуре инвалидизации и смертности, в том числе, преждевременной, а также ведут к эскалации расходов на здравоохранение. Поскольку морфологической основой смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в 90% случаев является атеросклероз, то вклад заболеваний атеросклеротического генеза и их последствий в России в общую смертность является наиболее весомым. Одной из причин этого неблагоприятного дисбаланса является недостаточное количество верифицированных биомаркеров ССЗ, и, в частности, атеросклероза.
       По литературным данным, в патологии человека показана ассоциация различных заболеваний с некоторыми мутациями митохондриального генома [1-3]. Митохондриальные мутации ассоциируются с различными заболеваниями, часто встречающимися в сочетании с атеросклеротическими поражениями, такими как стеноз коронарных сосудов, некоторые формы диабета и глухоты, инфаркт миокарда, кардиомиопатия. 
      Согласно одной из гипотез, мутации митохондриального генома вызывают окислительный стресс или свободно-радикальное окисление в организме человека.  Эта гипотеза объясняет широкий круг патологических процессов, вызванных митохондриальными мутациями. Помимо прямого разрушения клеток свободные радикалы часто являются виновниками таких заболеваний, как атеросклероз, болезни сердца и сосудов, диабет, онкологические заболевания и т.п. Появление и накопление мутаций  в митохондриальной ДНК вызывает увеличение перекисного окисления липидов и белков мембран, а также окислительное повреждение белков свободными радикалами.   
      Следует отметить, что в каждой митохондрии содержится несколько копий ее генома. Митохондриальный геном наследуется по материнскому типу и отличается выраженной нестабильностью, в нем часто возникают мутации. Пенетрантность и экспрессивность таких мутаций варьируют в широких пределах от семьи к семье и между родственниками (по материнской линии) одной семьи и зависят от многих факторов, но главным образом, от генотипа и уровня гетероплазмии (смесь мутантных и нормальных молекул ДНК). Поэтому при изучении ассоциации митохондриальных мутаций с заболеваниями людей необходима не только качественная (наличие/отсутствие мутации), но и количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома (процент гетероплазмии).
      В настоящей работе проведен молекулярный анализ мутации 652insG  митохондриального генома человека в образцах ДНК из нормальной и пораженной атеросклерозом интимы аорты человека, а также из лейкоцитов крови пациентов, больных атеросклерозом и здоровых доноров. Мутация локализована в кодирующей области митохондриального генома, в частности, в гене рРНК 12S. Данная мутация вызывает дефект малой субъединицы рибосомальной РНК, вследствие чего нарушается синтез митохондриальных белков. По литературным данным, мутация 652insG ассоциирована с митохондриальными миопатиями  [4] .     

Материалы и методы

       Материалом для данного исследования служили образцы ткани из интимы аорты, печени и мышцы, полученные из аутопсийного материала 7 лиц, погибших в результате несчастного случая или внезапной смерти. Кроме того, использовались образцы лейкоцитов крови 190 пациентов (84 мужчин в возрасте старше 30 лет, средний возраст 63,9 (SD=10,2) лет, и 106 женщин в возрасте старше 46 лет, средний возраст 65,8 (SD=8,6) лет).      
      Образцы крови были взяты у пациентов, входящих в группу риска: страдающие одним из заболеваний, наиболее часто ассоциированных с атеросклерозом (артериальной гипертонией, сахарным диабетом 2 типа, ишемической болезнью сердца, острым инфарктом миокарда, бронхиальной астмой, нарушением мозгового кровоснабжения) или здоровых мужчин старше 40 лет и женщин старше 50 лет.
      Для прижизненной диагностики атеросклероза использовали ультрасонографию высокого разрешения в В-режиме с использованием линейного сосудистого датчика с частотой 7,5 МГц с последующей компьютерной оценкой толщины интимо-медиального слоя (ТИМС) общих сонных артерий.
      Для определения степени предрасположенности к атеросклерозу использовали пограничные возрастно-половые значения показателя ТИМС, представленные в таблице 1. Абсолютные значения показателя ТИМС были перекодированы в квартильные показатели ординарной шкалы (1, 2, 3 или 4) в соответствии с величинами межквартильных границ, представленными в таблице 1. При этом, независимо от пола и возрастной группы, принадлежность к 1-й квартили рассматривали как признак низкой предрасположенности к атеросклерозу, принадлежность к 4-й квартили – как признак высокой предрасположенности к атеросклерозу. Принадлежность ко 2-й и 3-й квартилям рассматривали как соответствие возрастной норме.

Таблица 1.

Показатели толщины интимо-медиального слоя общих сонных артерий у мужчин и женщин в зависимости от возраста.

 
      При ультразвуковом обследовании также оценивали наличие атеросклеротических бляшек в бассейне сонных артерий с использованием ординарной (балльной) шкалы: (0) отсутствие атеросклеротических бляшек; (1) наличие гемодинамически незначимых атеросклеротических бляшек со стенозированием просвета сосуда до 20%; (2) наличие условно гемодинамически незначимых атеросклеротических бляшек со стенозированием просвета сосуда от 20% до 50%; (3) наличие гемодинамически значимых атеросклеротических бляшек со стенозированием просвета сосуда более 50%.
      В обследованной выборке 83 человека (44%) не имели атеросклеротических бляшек в бассейне общих сонных артерий, 61 человек (32%) имели бляшки 1-й степени, 46 человек (24%) имели бляшки 2-3 степени. По толщине интимо-медиального слоя общих сонных артерий 49 человек (1-я квартиль) были идентифицированы как не предрасположенные к атеросклерозу, 44 человека (4-я квартиль) – как предрасположенные к атеросклерозу, 97 человек (2-3 квартили) – как имеющие возрастную норму.
     
Выделение ДНК
      Выделение тотальной ДНК из образцов различных тканей (5-10 мг) или крови (5мл) проводилось с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. Визуализацию результатов выделения ДНК проводили  с помощью электрофореза  в горизонтальном аппарате в 0,8% агарозном геле.

ПЦР

      При амплификации фрагмента размером 467 п.н., содержащего область мутации 652insG, использовали следующие праймеры:

1.Прямой праймер TAGACGGGCTCACATCAC    ( 621 - 638 );

2.Обратный праймер bio-GGGGTATCTAATCCCAGTTTGGGT ( 1087 -  1064 ).

      Обратный праймер был биотинилирован в целях дальнейшего пиросеквенирования ПЦР-фрагмента.

      Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 0,4 - 0,6 мкг митохондриальной ДНК; 16,6 мкМ (NH4)₂SO₄; 0,3 пикомоль каждого праймера, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 67 мМ трис/HCl ( pH 8,8 ), 2,5 mM MgCL₂  и 3 ед. Taq-полимеразы.

      Режим ПЦР: денатурация ДНК при 94⁰ C в течение 3–х минут, затем:

94⁰ C – 45 сек., 60⁰ C –45 сек., 72⁰ C –1 мин., всего – 35 циклов, с заключительным синтезом при 72⁰ C  в течение 7 мин.

      Детекцию продуктов ПЦР проводили  с помощью электрофореза  в горизонтальном аппарате в 1,5% агарозном геле.

Пиросиквенс
      После проведения ПЦР амплификаты были пиросеквенированы для выявления инсерции G в гене субъединицы 12S в позиции 652 митохондриального генома человека. Исследования проводили на автоматическом пиросеквенаторе PSQTMHS96MA. При постановке эксперимента была использована схема приготовления проб, описанная в прилагающемся к пиросеквенатору методическом пособии.
      Последовательность праймера для сиквенса была следующей:
CCCATAAACAAATA  (639 - 651).
      Визуализация результатов осуществлялась с помощью программы, прилагающейся при установке пиросеквенатора.
Статистическая обработка
      Статистическую обработку данных проводили при помощи статистического пакета SPSS 14.0 (SPSS Inc., США). Данные представляли в виде среднего значения с указанием стандартного отклонения.

Молекулярно-генетическая диагностика:
Диагностика пациентов на предрасположенность к атеросклерозу проводилась следующим образом:
1)Проводилось тестирование образцов ДНК, выделенных из ткани или лейкоцитов  крови индивидов на наличие мутации  652insG;
2)Расчитывался процента гетероплазмии мутации 652insG в данных образцах;
3) На основании полученных данных по молекулярно-генетической  диагностике и ультрасонографическому обследованию делался вывод о том, имеется ли у индивида предрасположенность к возникновению и развитию атеросклероза.

Результаты и обсуждение

      Для количественной оценки мутантного аллеля, содержащего инсерцию G в позиции 652 митохондриального генома человека, мы использовали метод пиросеквенирования в нашей модификации. Метод пиросеквенирования основан на измерении вспышки, возникающей при взаимодействии АТФ с люциферином. Данная реакция катализируется ферментом люциферазой. Следует отметить, что АТФ образуется из пирофосфата, с помощью фермента сульфаразы. Пирофосфат (давший название всему методу пиросиквенса), в свою очередь, выделяется при взаимодействии нуклеотида, комплементарного нуклеотиду исследуемого биотинилированного одноцепочечного участка, с сиквенсовым праймером или очередным соседним нуклеотидом, которые уже встроены в комплементарную цепь [5-10].
      Благодаря разработанному авторами статьи методу возможна не только качественная  (есть мутация или ее нет), но и количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома (процент гетероплазмии ) в биологических образцах.
        Для подсчета процента гетероплазмии используется ранее  разработанная авторами формула №1 

где P – процент гетероплазмии

h –высота пика исследуемого нуклеотида,

N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% нормальных аллелей;

M – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей.

Пример подсчета процента гетероплазмии мутантного аллеля митохондриального генома по мутации 652insG  :

      Данную мутацию можно определить по пику нуклеотидов G. В анализируемой последовательности он находится под номером 2. По данным компьютерной программы, при 100% геномов с инсерцией ( +/+) пик G составляет 3 единицы (рис.1а), а при 100% нормальных геномов ( G/G ) пик G составляет 2 единицы (рис.1б). В качестве контроля берем пик G №5, составляющий 2 единицы.

      Таким образом, данный образец ДНК имеет 16% гетероплазмии по 652insG