МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Было обследовано 429 работников ТЭК г. Кемерово. В это число вошло 288 рабочих основных производственных цехов со стажем работы во вредных условиях труда 14,65 ± 0,48 лет (средний возраст - 41,87 ± 0,54 года) и 141 человек группы сравнения, не занятых на основном производстве (работники заводоуправления и Центра здоровья «Энергетик») со стажем работы 14,81 ± 0,74 лет (средний возраст составил 43,94 ± 0,73 лет).

Состояние здоровья оценивали устным анкетированием обследуемых в сочетании с анализом индивидуальных медицинских карт. Одновременно учитывали наличие  вредных привычек (курение). Все обследуемые к моменту сбора материала были практически здоровы, не принимали лекарственных препаратов и в течение 3-х месяцев до начала исследования не подвергались рентгенологическим обследованиям.

Материалом для исследования послужила цельная периферическая кровь, забиравшаяся  в период медицинских осмотров. Культивирование клеток крови осуществляли по стандартному полумикрометоду [Hungerford P.A., 1965]. Питательную смесь готовили из расчета: среда RPMI–1640 (4 мл), сыворотка крупного рогатого скота (1 мл) и 0,1 мл фитогемагглютинина (ПанЭко). Смесь помещали в стерильные культуральные флаконы и добавляли 0,5 мл гепаринизированной крови. Культуральные флаконы выдерживали при 37⁰С в течение 48 ч. За 2 часа до фиксации в культуры вводили колхицин (0,5 мкг/мл). После гипотонической обработки и фиксации клеток суспензию раскапывали на охлажденные чистые предметные стекла и высушивали над пламенем спиртовки. Препараты окрашивали 1% красителем Гимза (Merk) и анализировали под микроскопам Axioskop 2 plus (Carl Zeiss). 

Для учета хромосомных аберраций (ХА) у каждого индивида проанализировано по 100 метафаз. Регистрировали аберрации хромосомного и хpоматидного типов в соответствии с общепринятыми требованиями [Бочков Н.П, 1971]. Пpобелы в анализ не включали. Уровень ХА определяли путем подсчета частоты метафаз c аберрациями хромосом (в процентах от изученного числа клеток).

Для анализа полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков выделяли геномную ДНК из периферической крови с помощью метода фенол–хлороформной экстракции, образцы ДНК растворяли в 10 mM Tris/1 EDTA,    pH 8,0 и хранили при -20⁰С. Тест системы для молекулярно-генетического анализа полиморфизма CYP1A1, CYP1A2*1F, GSTT1 и GSTM1 разработаны в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск).

Полиморфизм генов CYP1A1*2А (3801 T>C) и CYP1A2*1F (-164 С>A) проводили с помощью методов ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктазы Bst2U   («СибЭнзим», г. Новосибирск) и детектировали в 7% полиакриламидном геле с последующей окраской в растворе бромистого этидия.

Типирование генов GSTM1 и GSTT1 проводили методом мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени. Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР были выбраны внутри области делеций  в генах GSTM1 и GSTT1 таким образом, что обуславливало отсутствие синтеза соответствующего продукта ПЦР при анализе образцов ДНК с генотипами           GSTM1 «0/0» или GSTT1 «0/0», соответственно. Для того, чтобы отличить наличие гомозиготной делеции в генах GSTM1 и GSTT1 от отсутствия ДНК матрицы или ингибирования реакции ПЦР в амплификационную смесь вводили внутренний контроль, в качестве которого использовали фрагмент генома условно обозначаемого LTM - от  «low temperаture melting». Результаты интерпретировали исходя из анализа графиков накопления флуоресценции. Специфичность оценивалась с помощью кривой плавления, так для LTM температура плавления составляла 78⁰С, для GSTM1 – 86,5⁰С, а GSTT1 - 91⁰С. Отсутствие флуоресцентного сигнала указывало на гомозиготность индивидуума по делеции гена («0/0»). Гетерозиготы по мутации (генотип «+/0») рассматривались в одной группе с носителями нормальных   генов («+»).

Распределение всех использованных показателей сравнивалось с нормальным (методом Колмогорова-Смирнова). По результатам анализа установлено, что распределение всех изучаемых цитогенетических параметров отличалось от нормального. На основании этого в дальнейшем для сравнения групп использовали ранговый U-тест Манна-Уитни. Принимая во внимание проблему множественных сравнений, для исключения ошибки первого типа использовали поправку Бонферрони (Bonferroni) и получали новое значение P_cor. Сравнение частот генотипов проводили с помощью четырехпольной таблицы сопряженности с поправкой Йетса на непрерывность вариации (c²). Нулевую гипотезу отвергали при p≤0,05. При условии, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали двусторонний критерий Фишера. Силу ассоциации полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и повышенного уровня хромосомных аберраций определяли с помощью величины относительного риска    (RR) [9]. Для RR рассчитывали  доверительный интервал (CI) при 95% уровне значимости. Считали, если RR=1, то ассоциация отсутствует. Если RR<1, то ассоциация отрицательная; если RR>1, то данная ассоциация положительная.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В результате проведенного анализа было установлено статистически значимое отличие по частоте хромосомных нарушений между группой рабочих (3,89 ± 0,15%) и группой сравнения 2,06 ± 0,17% (U_M-W = 11298,00; р < 0,001).  Причем, уровень ХА в изученных группах не зависел от возраста или пола.

В исследуемой группе общее увеличение частоты аберраций достигается за счет одиночных фрагментов и нестабильных обменов хромосомного типа, представленных дицентрическими хромосомами. Увеличение частоты встречаемости маркерных для облучения ХА (дицентриков) является характерным для контингентов работников предприятий, связанных с переработкой каменного угля и других полезных ископаемых [Дружинин В.Г. и др., 2003]. Самые высокие значения ХА в исследуемой группе   имели  рабочие, проработавшие на ТЭК более 30 лет – 4,23 ± 0,60%. Сравнивая различные цеха можно отметить, что наиболее высокие значения имели рабочие химических цехов - 4,13 ± 0,62%.

Далее изучали полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в исследуемых группах. Проведенное исследование показало, что в обеих исследуемых группах в гене CYP1A1 была характерна высокая частота аллеля T (исследуемая группа - 58,66%, группа сравнения – 66,96%) и низкая – аллеля C (исследуемая группа - 41,34%, группа сравнения – 33,04%), также высокая частота генотипа T/T (исследуемая группа - 34,65%, группа сравнения – 48,21%)  и низкая C/C (исследуемая группа - 17,32%, группа сравнения – 14,29%). Носители мутантного аллеля C обладают более высокой активностью фермента, а дикого аллеля T – низкой активностью фермента. Статистически достоверных различий между группами в распределении генотипов и аллелей CYР1А1 не было найдено.

Генотипирование  CYP1A2*1F показало, что в исследуемой группе, как и в группе сравнения присутствовали как носители дикого аллеля С, детерминируего низкую активность фермента (исследуемая группа - 28,44%, группа                   сравнения – 29,79%), так и мутантного аллеля А, детерминирующего высокую активность фермента (исследуемая группа - 71,56%, группа сравнения – 70,21%). Распределение частот генотипов и аллелей гена CYP1A2*1F у рабочих и в группе контроля не имели достоверно значимых отличий.

Гены GSTM1 и GSTT1 анализировались на наличие, либо отсутствие делеции («+» - нормальная активность, «0» - дефект фермента). Частота GSTМ1 «0/0» в исследуемой группе составила 40,08%, а в группе сравнения - 47,01% (χ²=1,47; p=0,225). Частота гомозигот по делеции гена GSTT1 в исследуемой группе       составила 33,68%, что несколько выше (но статистически не значимо), чем в контрольной группе - 24,11% (χ²=1,92; p=0,16).

Таким образом, проведенный сравнительный анализ изученных полиморфизмов генов I-й и II-й фазы биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1*2А, CYP1A2*1F,  GSTМ1,  GSTT1) в группах рабочих и контрольных доноров выявил статистически значимые отличия в частоте распределения делеционных вариантов гена GSTT1 в исследуемой группе, что может свидетельствовать о селективных процессах в производственной группе.

Результаты связи хромосомных нарушений с полиморфными вариантами генов I-й и II-й фазы биотрансформации ксенобиотиков представлены в таблице.

Таблица

Частота метафаз с хромосомными аберрациями у доноров с различными генотипами системы биотрансформации ксенобиотиков

Примечание: Исследуемая группа и группа сравнения во всех случаях достоверно отличалась по частоте ХА; p<0,05;

* - p <0,05, достоверное отличие от доноров с генотипами  С/T и T/T гена CYP1A1 исследуемой группы;

** - p <0,05, достоверное отличие от доноров с генотипом GSTM1 «+» исследуемой группы;

*** - p <0,05, достоверное отличие от доноров с генотипом GSTT1 «+» исследуемой группы;

# - p <0,05, достоверное отличие от доноров с генотипом GSTM1 «+» группы сравнения

Таким образом, было установлено, что большую частоту аберрантных метафаз имели рабочие:

·                    с мутантным гомозиготным генотипом С/С гена CYP1A1 (4,88 ± 0,31%), по сравнению с генотипом С/Т CYP1A1 (4,07 ± 0,35%; U_M-W=320,00; р=0,029) и генотипом Т/Т гена CYP1A1 (3,79 ± 0,34;   U_M-W=222,00; р=0,019);

·                    с генотипом GSTМ1 «0/0» (4,33 ± 0,29%), по сравнению с генотипом GSTМ1 «+»  (3,49 ± 0,19%; U_M-W=5394,50; р=0,036);

·                    с генотипом GSTT1 «0/0» (4,66 ± 0,34%), по сравнению с генотипом  GSTT1 «+» (3,46 ± 0,16%; U_M-W=6156,00; р=0,005).

В группе сравнения на частоту ХА влияние оказывал лишь генотип GSTМ1. У доноров с GSTМ1 «+» частота ХА- 1,76 ± 0,21%, а с генотипом GSTМ1 «0/0» 2,57 ± 0,30% (p <0,05).  Генотип CYP1A2*1F не модифицировал частоту ХА как в группе рабочих, так и в группе сравнения.

ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы появились публикации по выявлению связи генетического полиморфизма с различными цитогенетическими нарушениями у лиц, контактирующих с потенциальными мутагенами и канцерогенами окружающей среды. Так, в работе Григорьевой с соавторами было обнаружено, что нулевые генотипы GSTM1 и GSTT1 ассоциированы с более высоким уровнем ХА, индуцированных in vitro химическими мутагенами [Григорьева С.А. и др., 2007]. Была установлена взаимосвязь между частотой ХА и наличием GSTT1 «0/0» генотипа [Sram R.J., 1998]. Причем у таких индивидуумов, если они курят, мутагенный и канцерогенный риски выражены особенно сильно.

В то же время, у лиц, подвергающихся интенсивно­му мутагенному воздействию стирола, подобных ассоциаций выявлено не было [Vodicka P. et al., 2001]. При обследовании дорожных рабочих, проклады­вающих туннели и подвергающихся воздействию пыли, диоксида азота, дизельных выхлопов и масел, было установлено, что полимор­физм генов CYP1A1 и GSTM1 не оказывал значимого влияния на уровень сестринских хроматидных обменов  (СХО) и микроядер  [Villarini M., 2008].

Противоречивость результатов полученных разными авторами, по всей видимости, кажущаяся, поскольку корректные заключения можно делать только при условии учета совокупности таких факторов, как точное соответствие экспозиции и ферментных систем, отвечающих за эффекты, носительство других генов, способных влиять на нестабильность генома, возраст, курение, эмоциональная дезадаптация          и пр. [Ингель Ф.И., 2006].

В данном исследовании получены свидетельства значимости полиморфизма генов CYP1A1, GSTМ1 и GSTT1 в формировании ХА в результате комплексного воздействия неблагоприятных факторов условий труда на тепловых электростанциях.

У 47% обследованных рабочих уровень ХА был выше среднего (3,89%) и составил, в среднем, 6,06%. Обнаружили, что у рабочих с частотой ХА ≥ 3,89% статистически значимо чаще встречался генотип С/C гена CYP1A1 (21,54% против 5,66% соответственно; χ²=4,75; p=0,02; RR=4,06; 95%CI 2,01-10,24), генотип         GSTM1 «0/0» (48,11% против 34,40% соответственно; χ²=3,92; p=0,04; RR=1,76;     95%CI 0,67-4,62), генотип GSTT1 «0/0» (38,71% против 26,57% соответственно; χ²=3,94; p=0,04; RR=1,74; 95%CI 0,69-4,35), комбинация генотипов GSTM1 «0/0» и GSTT1 «0/0» (22,33% против 7,32%; χ²=9,20, p=0,02; RR=3,52; 95%CI 1,76-7,02). Сопоставление сочетаний генотипов GSTM1 и GSTT1 с CYP1A1 и CYP1А2*1F у рабочих с высоким и низким уровнем ХА не выявило статистически значимых отличий между ними. Вероятно, это связано с малочисленностью подгрупп, что требует продолжения исследований в данном направлении.

Заключение

В результате проведенного исследования можно заключить, что производственные факторы теплоэнергетического комплекса оказывают негативное воздействие на генетический аппарат рабочих, что выражается в высоком уровне ХА. Особенно высокую генотоксическую чувствительность демонстрируют лица с генотипами: GSTM1 «0/0», GSTT1 «0/0», CYP1A1 С/C. Результаты проведенного исследования подтверждают адекватность  применения комплексного анализа хромосомных нарушений и полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в системе оценки индивидуального генотоксического риска у рабочих промышленных предприятий.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.      Бочков Н.П. Хромосомы человека и облучение. М.: Атомиздат, 1971.  С. 13 – 17.

2.      Григорьева С.А., Никитина В.А., Ревазова Ю.А. Связь аллельных вариантов генов детоксикации ксенобиотиков с цитогенетическим ответом на действие мутагена // Гигиена и Санитария. – 2007. - № 5. - C. 62-63.

3. Дружинин В.Г., Мокрушина Н.В., Минина В.И., Волков А.Н. Генотоксические  эффекты у работников горно-обогатительного производства // Медицина труда и пром. экология. -2003.- № 12. -С. 21-23.

4. Ингель Ф.И. Перспективы использования микроядерного теста на лимфоцитах крови человека, культивируемых в условиях цитокинетического блока // Экологическая генетика. – 2006.- № 4. – C. 39-54.

5. Киреев Г.В., Татарский В.П., Маркова Е.Б. Содержание канцерогенных веществ в воздухе рабочей зоны предприятий теплоэнергетики // Гигиена и санитария. – 1990.- №10. – С.36-38.

6. Панаиотти Е.А., Суржиков Д.В. Комплексная оценка условий труда и риска для здоровья работающих в основных цехах тепловых электростанций // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. – 2007.- №1. – С.56-62.

7. Савченко Я.А., Дружинин В.Г., Минина В.И., Глушков А.Н., Ахматьянова В.Р., Остапцева А.В., Шабалдин А.В., Ветрова И.В. Цитогенетический анализ генотоксических эффектов у работников теплоэнергетического производства // Генетика. – 2008.- том 44.- №6. – С.857-862.

8. Hungerford P.A. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood and the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl // Stain Techn. 1965. -V.40. -P. 333-338.

9. Sram R.J. Effect of Glutathione transferase Ml Polymorphisms on Biomarkers of exposure and Effects/ Environ. Hlth Perspect. - 1998. – Vol. 106. – suppl. l. – P. 231-239.

10.Villarini M., Moretti M., Fatigoniet C., Agea E., Dominici L., Mattioli A., Volpi R., Pasquini R. Evaluation of Primary DNA Damage, Cytogenetic Biomarkers and Genetic Polymorphisms for CYP1A1 and GSTM1 in Road Tunnel Construction Workers // Journal of Toxicology and Environmental Health. – 2008. - Part A.-Vol. 71.-Issue 21. -P. 1430-1439.