Авторы: Чечушков А.В., Ткачев В.О., Шестопалов А.М., Потапова О.В,. Лузгина Н.Г., Шкурупий В.А.

Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (г. Новосибирск)

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Фундаментальные науки и практика" с материалами Третьей Международной Телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии" - Том 1 - №4. - Томск - 2010.

 
    Вирус гриппа А является высокопатогенным и инфицирует разнообразные виды животных, включая птиц, млекопитающих, птиц и, в том числе, человека. В природе существует большое разнообразие штаммов вирусов группы А, отличающихся поверхностными белками – гемагглютинином и нейраминидазой. Основным природным резервуаром вируса гриппа А являются водоплавающие птицы, и для начала циркуляции в человеческой популяции ему необходима адаптация в организме промежуточных носителей (млекопитающих), которыми чаще всего служат свиньи. Однако периодически наблюдают случаи  преодоления вирусом межвидового барьера, зачастую приводящие к развитию летальных инфекций у млекопитающих и человека. [Webby R.J., 2001]. Такими свойствами обладает, например, вирус гриппа подтипа A H1N1, вызвавший пандемию гриппа «испанки», и, вероятно, этим же объясняются тяжелые случаи инфицирования людей вирусом H5N1, зарегистрированные в период с 1997 по 2007 год в 14 странах Азии, Ближнего Востока, Восточной Европы и Африки. Доказано, что в патогенезе вирусной инфекции у млекопитающих, обусловленной вирусами гриппа H5N1, важную роль играет чрезмерная модуляция иммунного ответа, в частности гиперпродукция провоспалительных цитокинов IL-1 и TNFα [Perrone L.A., 2010]. В этой связи, для уточнения особенностей патогенеза гриппа, обусловленного «зоонозными» штаммами,  у млекопитающих, актуальной задачей является изучение  особенностей реагирования иммунной системы макроорганизма, обусловленных его генотипом и влиянием окружающей среды.
Цель работы – исследование особенностей развития иммунного ответа при инфицировании различными штаммами вируса гриппа А оппозитных по типу реагирова-ния иммунной системы линий мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
В работе использовали мышей линий CBA и С57Bl6/g, возрастом 2 месяца, интактных и зараженных патогенными для млекопитающих штаммами вируса гриппа А H1N1 и A H5N1.
Для анализа цитокинового профиля интактных животных использовали 24- и 48-часовые культуры спленоцитов, стимулированные митогеном (форбол-12-миристат-13-ацетатом в сочетании с иономицином). Сыворотку у инфицированных вирусами гриппа А мышей получали на 1, 3 и 6 сутки после заражения. Анализ уровня IL-2, IFNγ, TNFα, IL-4, IL-6, IL-10 и IL-17A проводили на проточном цитофлуориметре FACSСalibur (Becton Dickinson, США) с использованием тест-системы СВА Th1/Th2/Th17 mouse cytokine set (BD Pharmingen, США). Содержание IFNα определяли иммуноферментным методом, используя коммерческие тест-системы (PBL Interferon Source, США). Статистическую обработку данных проводили, используя непараметрический U-критерий Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Стимуляция митогеном спленоцитов, выделенных от мышей линии C57Bl6/g приводит к резкому (более чем в 20 раз) увеличению продукции Th1-ассоциированных цитокинов (IL-2, IFNg), пятикратно превышая аналогичные показатели, характерные для мышей линии СВА. Для спленоцитов мышей линии C57Bl6/g также характерен боле высокий уровень стимулированной продукции TNFα, превышающий аналогичное значение в группе мышей оппозитной линии в 3 раза. Наиболее существенным межлинейным различием является способность лимфоцитов селезенки к синтезу IL-17A после активации митогеном. Поскольку форбол-12-миристат-13-ацетат и иономицин являются неспецифическими стимуляторами, полученные результаты могут свидетельствовать о генетически-обусловленных различиях в функционировании лимфоцитарного-звена иммунитета. А именно, для С57Bl6/g характерны склонность к развитию Th1- и Th17-опосредованных иммунных реакций, тогда как мыши линии CBA более предрасположены к индукции Th2-зависимого ответа.
После инфицирования мышей линий СВА и C57Bl6/g вирусами гриппа А H1N1 и H5N1 существуют различия в иммунном ответе в зависимости как от линии животных, так и от субтипа вируса. В первые сутки после заражения мышей вирусом H1N1 в сыворотках крови животных не наблюдали достоверных межлинейных различий в содержании исследуемых цитокинов. На 3 сутки после инфицирования у мышей CBA двухкратно увеличивается уровень IFNγ, а к шестым суткам его содержание возрастает еще в 6 раз. У мышей С57Bl6/g на протяжении всего периода наблюдения существует лишь тенденция к увеличению уровня продукции цитокинов Th1-профиля, за исключе-нием достоверного девятикратного повышения сывороточного содержания IFNγ на 6 сутки эксперимента. В целом можно сказать о том, что противовирусный иммунный ответ на инфицирование вирусом гриппа А H1N1 у мышей линии CBA развивается существенно быстрее и является более выраженным. Интересно, что у мышей C57Bl6/g отмечено увеличение уровня IL-17A в первые сутки после инфицирования, а в дальнейшем – тенденция к его постепенному снижению.
В случае заражения вирусом H5N1 у мышей линии CBA резко возрастают сыво-роточные концентрации IL-2 и IFNγ, намного превосходя аналогичные показатели мышей оппозитной линии. Следует отметить, что пик продукции IFNγ в данном случае приходится на 3 сутки после заражения, тогда как IL-2, IL-4 и IL-6 достигают максимальных концентраций на 6 сутки. Так же как при инфицировании вирусом H1N1 на протяжении периода наблюдения у мышей C57Bl6/g не было зафиксировано признаков активации Th1-звена иммунной системы (например, уровни IL-2 и IFNγ не различались на всех сроках наблюдения). В данном случае прослеживается четкая тенденция к увеличению продукции IL-17A на 6 сутки эксперимента, характерная для мышей обеих исследуемых групп.
Развитие инфекции, вызванной вирусом гриппа А H5N1 у мышей C57Bl6/g сопровождается на 3 сутки после заражения увеличением сывороточной концентрации интерферона I типа IFNα, которая затем снижается. Содержание данного цитокина в сыворотке крови мышей CBA на всех сроках наблюдения находится ниже предела чувствительности используемой тест-системы.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что у линии C57Bl6/g при инфицировании вирусами гриппа A H1N1 и H5N1, иммунный ответ в целом несколько замедлен по сравнению с линией CBA. Отсутствие признаков активации иммунной системы может быть связано с подавлением репликации вирусных частиц интерферонами первого типа, в частности IFNα, продукция которого в большей степени возрастает при инфицировании мышей линии C57Bl6/g. Несмотря на склонность к развитию Th2-опосредованных реакций, при инфицировании мышей СВА вирусами гриппа А H1N1 и H5N1 происходит преимущественная активация Th1-звена иммунитета (хотя Th2-лимфоциты, очевидно, также вовлечены в инфекционный процесс). Снижение содержания IL-17A в сыворотках мышей С57Bl6/g в течение 6 суток после инфицирования вирусом H1N1, и тенденция к постепенному увеличению уровня Th1-ассоциированных цитокинов могут отражать определенный антагонизм субпопуляций Th17 и Th1 при развитии специфического противовирусного ответа [Ghilardi N., 2007]. Существует ряд наблюдений, указывающих на то, что активация Th17 клеток продуцируемым в очаге воспаления макрофагами интерлейкином-23 может быть первичным ответом лимфоцитарного звена иммунной системы на вирусную инфекцию [Mortellaro A., 2009].

ЛИТЕРАТУРА.
1. Ghilardi N., Ouyang W. Targeting the development and effector functions of TH17 cells. Seminars in Immunology. 2007, 19, pp. 383–393.
2. Mortellaro A., Robinsony L., Ricciardi-Castagnoli P. Spotlight on mycobacteria and dendritic cells: will novel targets to fight tuberculosis emerge? EMBO Molecular Medicine. 2009, 1, pp. 19–29.
3. Perrone L.A., Szretter K.J., Katz J.M. et al. Mice lacking both TNF and IL-1 receptors exhibit reduced lung inflammation and delay in onset of death following infection with a highly virulent H5N1 virus. Journal of Infection Disease. 2010, 202(8), pp.1161-70. 
4. Webby R.J., Webster R.G. Emergence of influenza A viruses.  Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2001, 356(1416), pp. 1817-28.