1 Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук;
2 Научно-исследовательский институт атеросклероза Российской академии естественных наук;
3 ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития России, г. Москва.
                                                    
Резюме
Разработан и апробирован метод прямого количественного измерения степени гетероплазмии митохондриального генома, необходимый для определения критического уровня гетероплазмии митохондриальных мутаций, ассоциированных с возникновением и развитием патологий в организме человека. Метод основан на пиросеквенировании коротких фрагментов ДНК, обладает высокой точностью и достаточной воспроизводимостью. Использование данного метода позволило выявить существенные различия в степени гетероплазмии митохондриального генома в различных тканях, полученных от одного и того же индивида.

Введение
По литературным данным, в патологии человека показана ассоциация различных заболеваний с рядом мутаций митохондриального генома. Митохондриальные мутации выявлены при различных патологиях, таких как стеноз коронарных сосудов, некоторые формы диабета и глухоты, атеросклероз, инфаркт миокарда, кардиомиопатии.

Митохондриальный геном наследуется по материнскому типу. Вследствие прохождения в митохондриях процессов дыхания, геном этих органелл отличается выраженной нестабильностью, поэтому в нем нередки соматические мутации, возникающие в течение жизни индивида. Пенетрантность и экспрессивность таких мутаций варьируют в широких пределах и зависят от многих факторов, но главным образом, от генотипа и уровня гетероплазмии, который представляет собой отношение количества фрагментов митохондриальных геномов, несущих замену, инсерцию или делецию в исследуемой позиции, к общему их количеству.
Таким образом, при изучении ассоциации митохондриальных мутаций с заболеваниями человека необходима не только качественная (наличие/отсутствие мутации), но и количественная оценка мутантного аллеля митохондриального генома (процент гетероплазмии).
Для определения критического уровня гетероплазмии митохондриальных мутаций, ассоциированных с возникновением и развитием патологий в организме человека, был разработан метод прямой количественной оценки митохондриального генома. 

Материалы и методы

Материалом для данного исследования служили образцы ткани из стенки сосуда, печени и мышцы лиц, погибших в результате несчастного случая или внезапной смерти.
Выделение тотальной ДНК из образцов различных тканей (5-10 мг) проводилось с помощью метода фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. Визуализацию результатов выделения ДНК, а так же последующую визуализацию результатов амплификации проводили  с помощью электрофореза  в горизонтальном аппарате в 0,8-2% агарозном геле.
Далее был проведён ряд ПЦР с праймерами («Синтол», Москва, Россия) на область мутаций. Условия проведения реакции (концентрация агентов в реакционной смеси, а так же аппаратный режим) для различных мутаций были специально подобраны в предварительных экспериментах.

После проведения ПЦР амплификаты были пиросеквенированы для выявления точечных замен или микроделеций с помощью соответствующих праймеров («Синтол», Москва, Россия). Исследования проводили на автоматическом пиросеквенаторе PSQ^TMHS96MA. При постановке эксперимента была использована схема приготовления проб, описанная в прилагающемся к пиросеквенатору методическом пособии. Визуализация результатов осуществлялась с помощью программы, прилагающейся при установке пиросеквенатора.

            Статистическую обработку данных проводили при помощи статистического пакета SPSS 14.0 (SPSS Inc., США). Данные представляли в виде среднего значения с указанием стандартного отклонения.

     Результаты

Количественную оценку мутантного аллеля проводили на основании анализа высоты пиков пирограммы в исследуемой области одноцепочечного ПЦР-фрагмента митохондриального генома. Задача заключалась в оценке процента гетероплазмии по исследуемой мутации. Пирограмма для митохондриальных генов отличается от таковой для ядерных, так как для последних существует чёткое разделение на гомо- и гетерозигот, что делает высоту пиков на пирограмме фиксированной (0% - индивид гомозиготен, оба аллеля не несут мутации, 50% - гетерозигота, и 100% - пациент гомозиготен, оба аллеля мутантны). Для мутаций же митохондриального генома, проанализировав отличия в последовательности и размере пиков для гомозигот, имеющих 100% нормальных и 100% мутантных аллелей, мы можем определить процент гетероплазмии в образце ДНК для каждой конкретной мутации. Общая формула для подсчёта процента гетероплазмии выглядит следующим образом:

где P – процент гетероплазмии; h –высота пика исследуемого нуклеотида, N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% нормальных аллелей;M – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей.

Пример расчета процента гетероплазмии мутации митохондриального генома представлен на рисунке 1.

В данном случае проводится детекция замены G®A.

Как следует из гистограммы, позиция Т₁ является контрольной и в 100% случаев представлена тимином в митохондриальной ДНК человека (согласно данным NCBI, Human genome resources). При 100% митохондриальных геномов с нуклеотидом G в данной позиции размер пика A₂ на теоретической гистограмме будет 0 ед. и и пика G₃ - 1 ед. (рис.1a); при 100% геномов с нуклеотидом A в данной позиции – 0 ед. G₃ и 1 ед. A₂ (рис.1б). Для подсчета процента гетероплазмии мутантного аллеля мы принимаем сумму исследуемых пиков за 1 единицу, а затем подсчитываем процент гетероплазмии пика A₂.

При анализе образца ДНК из сосудистой ткани 29-летнего мужчины размер пика A на практической пирограмме был равен 0,84; а размер пика G - 3,05 (рис.1в). Сумма пиков составила 3,89, что было принято за 1 ед. теоретической пирограммы.

Рассчитываем процент гетероплазмии по данной замене:

Метод определения процента гетероплазмии мутантного аллеля митохондриального генома был опробован на различных органах и тканях, например, здоровой и пораженной атеросклерозом интиме аорты, печени и мышце (рис.2). Полученные результаты показали, что данный метод может быть использован для количественной оценки уровня гетероплазмии мутантного генома практически в любых биологических образцах.

Рисунок 1. Детекция мутации C->T (TG/AC).

а) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии при отсутствии замены G->A в 100% митохондриальных хромосом;

б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии при наличии замены G->A в 100% митохондриальных хромосом;

в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК (22% хромосом имеют мутантный аллель, то есть степень гетероплазмии составляет 22%).

Рисунок 2. Детекция замены G->A (AG/AA)

а) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по отсутствию замены G->A в 100% митохондриальных хромосом;

б) теоретическая высота пиков нуклеотидов при гомоплазмии по наличию замены G->A в 100% митохондриальных хромосом;

в) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК из участка сосудистой стенки №1 (степень гетероплазми 30%);

г) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК из участка сосудистой стенки №2 (степень гетероплазмии 20%);

д) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК из участка мышечной ткани (степень гетероплазмии 15%);

е) практическая пирограмма исследуемого образца ДНК из участка ткани печени ( степень гетероплазмии 8%).

Следует отметить, что при проведении стандартной экспериментальной серии, включающей в себя по 2-3 повторных измерения степени гетероплазмии в одном образце митохондриальной ДНК (n=46), был получен достаточный уровень воспроизводимости результатов: коэффициент вариации составил 19,5±13,4%, при этом абсолютное отклонение от среднего значения процента гетероплазмии в исследуемом образце ДНК в среднем составило 2,5±2,1%, что является показателем высокой разрешающей способности и универсальности предложенного метода.

Обсуждение

Для определения критического уровня гетероплазмии митохондриальных мутаций, ассоциированного с возникновением и развитием патологий в организме человека, был разработан и апробирован метод прямой количественной оценки митохондриального генома, основанный на пиросеквенировании коротких фрагментов ДНК.

            Метод пиросеквенирования основан на измерении вспышки, возникающей при взаимодействии АТФ, образующейся из пирофосфата с помощью сульфаразы, с люциферином [1-3]. Данная реакция катализируется люциферазой. Пирофосфат (давший название всему методу пиросиквенса), в свою очередь, выделяется при взаимодействии нуклеотида, комплементарного нуклеотиду исследуемого биотинилированного одноцепочечного участка, с сиквенсовым праймером или очередным соседним нуклеотидом, которые уже встроены в комплементарную цепь. Если же добавляемый в реакцию нуклеотид не комплементарен изучаемому участку ДНК, то выделения пирофосфата, а следовательно, и вспышки, не происходит. Интенсивность вспышки кратна количеству встроившихся нуклеотидов в комплементарной цепи.

В настоящее время описаны различные методы количественной оценки уровня гетероплазмии, например, с помощью ПЦР в режиме реального времени, анализа гетеродуплексов [2,4,5]. Однако эти методы имеют довольно существенный недостаток – значительно меньшую точность. При использовании данных методов размер анализируемой последовательности в среднем составляет 50-600 п.н. Напротив, пиросеквенирование обеспечивает возможность анализа области исследуемой мутации на очень короткой последовательности нуклеотидов – 5-10 п.н., что значительно увеличивает точность определения процента гетероплазмии мутантного аллеля.

Следует отметить, что были выявлены существенные отличия процента гетероплазмии митохондриального генома в различных тканях, полученных от одного и того же донора аутопсийного материала (данные не приводятся). Этот феномен требует дальнейшего изучения, поскольку может свидетельствовать о неравномерном и селективном распределении мутантного аллеля по различным тканям в процессе онтогенеза. С другой стороны, это может также свидетельствовать о преимущественном выживании клеток, несущих нормальный (или мутантный) аллель. Кроме того, нельзя также исключить возможность избирательного возникновения соматических мутаций в клетках тканей при локальных неблагоприятных воздействиях.

Заключение

Для изучения ассоциаций соматических митохондриальных мутаций с болезнями человека был разработан метод количественной оценки мутантного аллеля, который может быть использован в клинической диагностике заболеваний, ассоциированных как с соматическими, так и с наследственными мутациями митохондриального генома человека. Разработанный метод пригоден для анализа уровня гетероплазмии мутантного аллеля практически в любых биологических образцах

Список литературы

1. Alderborn A., Kristofferson A., Hammerling U. Determination of single-nucleotide polymorphisms by real-time pyrophosphate DNA sequencing. // Genome Res. 2000.-Vol.10.-pp.1249-1258.

2. Chen D.C., Saarela J., Nuotio I., Jokiaho A., Peltonen L., Palotie A. Comparison of GenFlex Tag array and Pyrosequencing in SNP genotyping. // J. Mol. Diagn. 2003.-Vol.5.-pp.243-249.

3. Sinclair A., Arnold C., Woodford N.. Rapid detection and estimation by pyrosequencing of 23S rRNA genes with a single nucleotide polymorphism conferring linezolid resistance in Enterococci. // Antimicrob. Agents Chemother. 2003.-Vol.47.-pp.3620-3622.

4. Adelson M.E., Feola M., Trama J., Tilton R.C., Mordechai E. Simultaneous detection of herpes simplex virus types 1 and 2 by real-time PCR and Pyrosequencing. // J. Clin. Virol. 2005.-Vol.33.-pp.25-34.

5. Galbiati S., Foglieni B., Travi M., Curcio C., Restagno G., Sbaiz L., Smid M., Pasi F., Ferrari A., Ferrari M., Cremonesi L. Peptide-nucleic acid-mediated enriched polymerase chain reaction as a key point for non-invasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia. // Haematologica 2008.-Vol.93.-pp.610-614.