Авторы: Жуковский Н.С., Карагодин В.П., Собенин И.А.

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН, АНО «Научно-исследовательский институт атеросклероза Российской академии естественных наук» (г. Москва)

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Фундаментальные науки и практика" с материалами Третьей Международной Телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии" - Том 1 - №4. - Томск - 2010.

 
В протеомике существенную проблему представляет отсутствие единой схемы анализа, которая упрощала бы сравнение данных, полученных в разных лабораториях. В этой связи время от времени предпринимаются попытки некоей стандартизации протеомических процедур, в том числе по инициативе международных научных организаций (HUPO) . Нами разработан экспериментальный алгоритм фракционирования образцов, разделения белков и их системной идентификации, примененный для изучения глобальной белковой карты кроветворных стволовых клеток.  Достигнута оптимизация использования доступных технологий, комбинирование которых позволило получить улучшенные результаты протеомного анализа. Главной особенностью предлагаемого методического подхода  является трехступенчатая процедура фракционирования биологического материала, ведущая к повышению эффективности разделения белков методом двумерного гель-электрофореза на полиакриламиде. Последующая идентификация белков проводится общепринятым методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF).
Таким образом, мы акцентируем основное внимание на важности подготовки образца (клеточного содержимого), включая ультразвуковое разрушение мембран и разделение субклеточных частиц, позволяющее в дальнейшем проводить анализ белков, присутствующих в низких концентрациях.  В частности, дифференциальное экстрагирование белков осуществляется с помощью коммерчески доступного набора реагентов ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit (S-PEK, Calbiochem, Germany). Этот набор содержит экстракционные буферные растворы, приготовленные с использованием соединений высокой чистоты, смесь протеаз и нуклеазу, устраняющую нуклеиновые кислоты.  Одним из преимуществ S-PEK является возможность избирательного и мягкого экстрагирования компонентов субклеточных структур специальными смесями реагентов. Таким образом, целый протеом превращается в субпротеомы меньшей сложности в отношении своего состава. Поэтапное применение трех буферных смесей позволяет последовательно выделить три фракции белков с растворимостью, изменяющейся от максимальной к минимальной. 
На следующей стадии работы применяется набор реагентов 2D Clean-Up Kit (Amersham Biosciences), завершающий и оптимизирующий подготовку образцов к двумерному гель-электрофорезу (2D-PAGE). Эти реагенты количественно осаждают белки, оставляя помехообразующие соединения в растворенном состоянии. Осадок отделяется центрифугированием, отмывается и ресуспендируется.  Следует подчеркнуть, что весь алгоритм работы с протеомом стволовых клеток требует не только стандартизации отдельных стадий, но и их автоматизации.
Использование разработанной последовательности операций позволило получить количественные и качественные характеристики протеома стволовых клеток на ранее недостижимом уровне и создать методическую платформу не только для идентификации белков, но и для контроля реакции белков на изменение клеточного окружения, например, белков кроветворных стволовых клеток, находящихся под влиянием факторов костного мозга.
На настоящем этапе развития проекта изучено стимулирующее воздействие паратиреоидного гормона (ПТГ) на остеобласты. Остеобласты, как известно, активируются паратиреоидным гормоном (ПТГ) или локально образующимся связанным с ним белком (PTHrP) через рецептор (PPR) к ним [1]. Мы изучали стимулирующее воздействие 34 N-терминальных аминокислот ПТГ на остеобласты с помощью методов протеомики. В экспериментах в качестве модели была использована клеточная линия остеобластподобной остеосаркомы MG63 человека. Для воспроизводимого 2-D гель-электрофореза использовалась оптимизирующая процесс гель-система Criterion (Bio-Rad). Сравнение ПТГ-стимулированных и нестимулированных клеток проводилось при их окрашивании красителем Imperial™. Анализ гелей осуществлялся с помощью компьютерной программы 2D Evolution (Nonlinear Dynamics). Для идентификации белков применялись обработка трипсином и MALDI масс-спектрометрия. 
Из предварительных результатов ясно, что ПТГ стимулирует выживание находящихся в стадии покоя (лишенных питания) остеобластов. Их отмирание, ассоциированное с фактором транскрипции 1, снижается в 4 раза после обработки ПТГ по сравнению с контролем. Эти данные дополняют ранее опубликованные сведения по исследованию протеома остеобластов из костного мозга мышей [2]. Таким образом, продемонстрировано, что методика является мощным инструментом для мониторинга изменений белка в ответ на гормональную стимуляцию.
Авторы подчеркивают, что протеомика должна использоваться главным образом для исследования совокупности (популяции) клеток, а не единичных клеток, поэтому критическим фактором репрезентативности результатов является гомогенность такой популяции. При учете этого требования с помощью методов протеомики можно наблюдать за посттрансляционными модификациями белков (например, фосфорилированием).
Еще более мощным инструментом является применение протеомики в сочетании с биоинформатикой, позволяющим регистрировать внутриклеточные изменения концентрации белков и изучать механизмы молекулярной сигнализации.

ЛИТЕРАТУРА

1 Calvi, L. M. 2006. Osteoblastic activation in the hematopoietic stem cell niche. Ann.N.Y.Acad.Sci. 1068:477-488.
2 Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Чертков И.Л. и Дризс Н.И. 2006. Изменение хоуминга кроветворных клеток-предшественников после длительного воздействия паратиреоидного гормона. Бюлл экспер биол мед 142: 97-101.