|
Авторы: О.А. Васильева, О.И. Уразова, В.А. Серебрякова, Т.Е. Кононова
ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава, Томск
Эта статья опубликована в сборнике по материалам российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии», посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета (ноябрь 2009, г. Томск)
Скачать содержание сборника
Скачать сборник целиком
В комплексе методов современной терапии туберкулеза ведущее положение занимает комбинированная этиотропная химиотерапия, при этом рифампицин является одним из основных наиболее эффективных антимикобактериальных лекарственных средств [4]. К недостаткам длительной комбинированной химиотерапии относятся лекарственные осложнения токсического характера, обусловленные как самими препаратами, так и продуктами их метаболизма [3]. Кроме того, в литературе высказывается мнение о том, что антибиотики, избирательно поражая Mycobacterium tuberculosis, способны оказывать в той или иной степени выраженное иммуносупрессорное действие, которое ограничивает возможности организма в борьбе с инфекцией [1].
Поскольку клиническая эффективность проводимого специфического лечения при туберкулезе определяется не только антибактериальной активностью противотуберкулезных препаратов, но и во многом состоянием реактивности макроорганизма (исходным и на фоне лечения), целесообразным является изучение влияния химиотерапии на параметры иммунного статуса, в том числе показатели функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Цитокины, выполняя функцию эндогенных медиаторов, контролируют процессы пролиферации, дифференцировки и апоптоза иммунокомпетентных клеток, регулируют амплитуду и продолжительность иммунного ответа [6].
В соответствии с современными представлениями о патогенезе туберкулеза процессы внутриклеточного метаболизма, митохондриальные, тиоловые и кальций-зависимые механизмы участвуют в реакциях апоптоза, приводящих к развитию остропрогрессирующих форм микобактериальной инфекции. При воспалении, вызванном микобактериями туберкулеза (МБТ), апоптоз может усиливать и (или) ослаблять воспалительные реакции, а также способствовать внутриклеточной персистенции МБТ [8]. При этом не исключено, что даже небольшое препарат-индуцированное изменение цитокинпродуцирующей активности и апоптоза лимфоцитов может сопровождаться нарушениями формирования полноценных иммунных реакций.
В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования стала оценка влияния рифампицина на продукцию интерлейкинов (IL) 2, 12 и интерферона ? (IFN-?) мононуклеарными лейкоцитами и апоптоз лимфоцитов периферической крови в условиях in vitro при инфильтративном туберкулезе легких.
Материалы и методы. В ходе работы было обследовано 30 впервые выявленных больных (20 мужчин и 10 женщин) с инфильтративным туберкулезом легких в возрасте от 18 до 55 лет. В зависимости от чувствительности возбудителя к основным ПТП все больные были распределены на две группы. Первую группу составили 15 пациентов, выделяющих микобактерии туберкулеза (МБТ), чувствительные к основным ПТП, во вторую группу было включено 15 пациентов, выделяющих МБТ, устойчивые как минимум к трем препаратам – изониазиду, рифампицину и стрептомицину. Контрольную группу составили 18 практически здоровых доноров с сопоставимыми характеристиками по полу и возрасту.
Материалом для исследования служила венозная кровь. Выделение мононуклеаров из цельной крови осуществляли методом градиентного центрифугирования (?=1,077). Изучение влияния рифампицина на продукцию мононуклеарами IL-2, IL-12, IFN-? проводили до начала специфической противотуберкулезной химиотерапии на модели индуцированной секреции. Для этого получали три вида супернатантов: от клеток, культивируемых в питательной среде (базальная); от клеток, культивируемых в питательной среде в условиях стимуляции; от клеток, культивируемых в питательной среде в условиях стимуляции в присутствии рифампицина. Для стимуляции секреторных способностей мононуклеарных лейкоцитов в пробы вносили комплексный белковый антиген, выделенный из микобактерий туберкулеза (МБТ) семейства Beijing, в дозе 20 мкг/мл.
Согласно данным С.И. Татькова и соавт. [2008], среди штаммов микобактерий туберкулеза, циркулирующих на территории Томской области, преобладают клинические изоляты семейства Beijing, высоко ассоциированные с множественной лекарственной устойчивостью.
В настоящее время микобактериальные антигены являются предметом разносторонних иммунохимических исследований. В виду того, что у микобактерий не существует единого доминирующего антигена, у зараженного или искусственно сенсибилизированного макроорганизма развивается гиперчувствительность к множеству микобактериальных протеинов [9]. В связи с этим, использование в работе микобактериального антигена штамма Beijing для индукции клеток позволит наиболее полно оценить ответную реакцию мононуклеаров крови на воздействие препарата.
Для оценки влияния химиопрепарата на цитокинпродуцирующую активность мононуклеаров и апоптоз лимфоцитов в питательную среду добавляли субстанцию рифампицина (Sigma) в дозе 10 мкг/мл (что соответствует средней концентрации препарата в плазме крови при стандартных режимах дозирования). Уровень апоптоза лимфоцитов оценивали по количеству CD95+- и annexin V-презентирующих клеток. Определение уровня продукции IL-2, IL-12, IFN-? осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа согласно инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем.
Результаты и обсуждение.
Проведенное исследование спонтанной цитокинпродуцирующей активности мононуклеарных лейкоцитов констатировало отсутствие изменений базальной секреции IL-2 и IL-12 у больных инфильтративным лекарственно-чувствительным туберкулезом легких (ЛЧТЛ), в то время как течение лекарственно-устойчивого туберкулеза легких (ЛУТЛ) сопровождалось увеличением уровня спонтанной продукции IL-12 на фоне снижения базальной секреции IFN-?.
Анализ биологических свойств IFN-? и IL-12 показывает, что они являются ключевыми цитокинами в защите организма от инфекций, вызванных внутриклеточными микроорганизмами, в том числе МБТ. Основным эффектом IL-12 является индукция синтеза IFN-? естественными киллерами и активированными CD4+, CD8+ Тh1-лимфоцитами. При этом возможными причинами установленной у больных ЛУТЛ низкой продукции IFN-? (на фоне высокой секреции IL-12) могли быть нарушения экспрессии рецепторов для IL-12 (IL-12R?2) на клетках-мишенях, костимулирующих молекул на антигенпредставляющих клетках (В7) или же нарушения на этапе каскада внутриклеточной передачи сигнала. Таким образом, увеличение продукции IL-12 у больных ЛУТЛ, механизм которого, по-видимому, носит компенсаторный характер, не является эффективным, поскольку не сопровождается активацией секреции IFN-?.
В присутствии белкового антигена МБТ уровень секреции IL-2 мононуклеарами периферической крови (как у здоровых доноров, так и у пациентов с ЛЧТЛ и ЛУТЛ) статистически значимо не изменялся. Вместе с тем, у здоровых индивидуумов инкубация мононуклеарных лейкоцитов с белковым антигеном МБТ сопровождалась увеличением стимулированной выработки IL-12, которая у больных туберкулезом легких вне зависимости от чувствительности возбудителя к основным ПТП оказалась ниже нормы. Стимулированная продукция IFN-? у больных ЛЧТЛ была выше, чем у здоровых доноров, тогда как у больных ЛУТЛ она была сопоставима с контролем, но значимо превышала базальный уровень секреции цитокина.
Выявленное повышение концентрации лишь IFN-? в ответ на стимуляцию клеток у больных туберкулезом легких, вероятно, связано с тем, что биосинтез цитокинов клетками иммунной системы является активным процессом, и каждый цитокин синтезируется в определенную стадию активации клетки-продуцента. Так, I.M. Orme et al. [1993] установили, что у мышей, инфицированных МБТ, в первую очередь продуцируется IFN-?, который затем индуцирует секрецию других регуляторных цитокинов.
Допустимо, что установленное нами отсутствие изменений продукции IL-2 в ответ на белковый антиген МБТ, а также снижение белок-стимулированной секреции IL-12 отражает отсутствие реакции антигенреактивных клеток на специфический стимулятор и свидетельствует об истощении их функционального резерва.
При инкубации клеток с белковым антигеном МБТ и рифампицином отмечалось увеличение продукции IL-2 (относительно уровня его спонтанной секреции) и угнетение синтеза IL-12 и IFN-? как у здоровых доноров, так и у больных ЛЧТЛ и ЛУТЛ (относительно уровня белок-стимулированной секреции).
Установленный факт увеличения продукции IL-2 в присутствии рифампицина, по-видимому, может расцениваться в качестве проявления как позитивного (за счет опосредованной IL-2 индукции процессов клеточного деления), так и негативного модулирующего влияния препарата. Последнее объясняется тем, что IL-2, выполняя роль проапоптотического фактора, стимулирует вхождение Т-лимфоцитов в пролиферацию (при этом именно в G1- и S-фазе клеточного цикла клетки наиболее чувствительны к индукции апоптоза) и повышает чувствительность лимфоцитов к апоптозу (за счет усиления образования DISC-комплекса и подавления синтеза ингибитора апоптоза – сFLIP). Кроме того, под действием IL-2 усиливается экспрессия FasL и образование ТNF-? [5]. В экспериментальном исследовании А.Б. Инсанова и соавт. [1998] было показано, что добавление рифампицина in vitro к лимфоцитам периферической крови оказывает выраженное иммуносупрессивное действие, способствующее угнетению спонтанного розеткообразования, что свидетельствует в пользу проапоптотического эффекта IL-2.
Определение уровня спонтанной экспрессии CD95-молекул на поверхности лимфоцитов периферической крови у больных инфильтративным туберкулезом и у здоровых доноров не выявило существенных различий между указанными группами. При этом исходное количество апоптозных лимфоцитов у больных ЛЧТЛ в 2 раза превышало их уровень в группе сравнения, а у больных ЛУТЛ было сопоставимо с контролем. После инкубации с рифампицином среднее количество CD95+ и annexin V-презентирующих лимфоцитов в среднем увеличилось в 2,0 и 1,8 раза соответственно относительно исходного уровня во всех группах обследованных. Однако у больных ЛЧТЛ и ЛУТЛ количество клеток, вступивших в апоптоз под действием рифампицина, соответственно было в 2,2 и 1,7 раза больше, чем у здоровых доноров.
Значительное увеличение количества annexin V+ лимфоцитов у больных туберкулезом легких по сравнению со здоровыми донорами свидетельствует о большей чувствительности клеток больных к экзогенным воздействиям, и, возможно, является одним из механизмов формирования вторичной иммунной недостаточности, опосредованной лекарственным воздействием.
Выводы:
1. У больных инфильтративным туберкулезом легких вне зависимости от чувствительности возбудителя к основным противотуберкулезным препаратам рифампицин инициирует повышение секреции IL-2 и снижает выработку IL-12 и IFN-? мононуклеарными лейкоцитами un vitro.
2. Рифампицин является индуктором апоптоза лимфоцитов, что подтверждается увеличением количества клеток, предуготовленных к апоптозу (CD95+) и вступивших в раннюю фазу клеточной гибели (annexin V+).
Список литературы:
1. Александрова, А.Е. Иммунотропная активность противомикробных средств, используемых во фтизиатрии / А.Е. Александрова, Т.И. Виноградова // Клиническая фарм. и терапия. – 1998. – №4. – С. 43-45.
2. Инсанов, А.Б., Абдуллаев Ф.М., Умняшкин А.А., Магеррамов А.А. Изучение модулирующего действия противотуберкулезных препаратов in vitro в реакции розеткообразования у больных туберкулезом легких // Проблемы туберкулеза. – 1998. – №4. – С. 44-46.
3. Лысов, А.В. О побочных нейротоксических реакциях при химиотерапии туберкулеза и их лечении / А.В. Лысов, А.В. Мордык, В.А. Затворницкий и др. // Проблемы туберкулеза. – 2006. – №9. – С. 45-48.
4. Мишин, В. Ю. Химиотерапия туберкулеза легких / В. Ю. Мишин // Пульмонология. – 2008. - №3. – С. 5-14.
5. Потапнев, М. П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами // Иммунология. – 2002. – Т. 23, №4. – С. 237–243.
6. Симбирцев, А.С. Цитокины: классификация и биологические функции // Цитокины и воспаление. – 2004. – Т.3, №2. – С. 16–21.
7. Татьков, С.И., Воронкова О.В., Уразова О.И. Циркуляция на территории Томской области M. tuberculosis генетического семейства Beijing // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2008. - Т. 41, №4. - С. 13-17.
8. Хоменко, А.Г. Повышенный апоптоз иммунокомпетентных клеток как один из возможных механизмов в развитии иммунодефицита у больных остропрогрессирующим туберкулезом легких / А.Г. Хоменко, Л.В. Ковальчук, В.Ю. Мишин и др. // Проблемы туберкулеза. – 1996. – №6.-С.6-10.
9. 9. Daniel, T.M. Туберкулез // Болезни, лечение болезни [Электронный ресурс]. – Электрон. дан. – Режим доступа: http://www.rusmedserver.ru/med/haris/107.html
10. Orme, I.M., Cooper A.M., Magram J., Ferrante J. Interleukin 12 (IL-12) is crucial to the development of protective immunity in mice intravenously infected with Mycobacterium tuberculosis // J. Exp. Med. – 1997. – Vol. 186. – P. 39–45.
|
