Научные руководители: д-р мед. наук, член-корр. РАМН, проф. А.В. Ефремов, канд. мед. наук, доц. Е.В.Овсянко
Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Эта работа была опубликована в cборнике материалов I Всероссийской научной студенческой конференции с международным участием «МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ: ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ», под редакцией проф., д-ра мед. наук С.И. Карася (г. Томск, 10-11 ноября 2011 года). 

Введение. Проблема регуляции клеточной пролиферации в нормальных и трансформированных клетках является одной из фундаментальных проблем медицины. В современных клинических и экспериментальных исследованиях при оценке эффективности и разработке противоопухолевой терапии основное внимание уделяется влиянию химических агентов на стимуляцию гибели опухолевых клеток, подавление их пролиферации, метастатической активности и неоангиогенеза.
Разные химические воздействия вызывают разную интенсивность изменений биологических свойств опухолей. Поэтому для выбора наиболее эффективного режима противоопухолевой терапии часто используют комбинированные воздействия, проводится поиск новых вариантов сочетания известных и неизвестных агентов с антибластомной активностью.

Цель работы изучить патоморфогенез и основные параметры опухолевого роста карциносаркомы Walker 256 при ее трансплантации в мышцу бедра крыс Вистар и при проведении противоопухолевой терапии с использованием циклофосфана, мелатонина и их сочетаний.

Материал и методы. В эксперименте использовали крыс самцов породы линии Wistar, массой 180-200 г. Работу с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации. Использовали перевиваемый штамм опухоли Walker256 (W256), поддерживаемый in vivo (Лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой карциносар-комы W256 вводили животным мышцу бедра в дозе 1 * 106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl [3]. Через 5 суток, с момента перевивки карциносаркомы Walker-256, измеряли ее размеры штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях и определяли объем опухоли.
Животных разделили на 4 группы (по 7 в группе): 1-я группа - контрольная группа - со «спонтанным» развитием карциносаркомы Walker256, 2-я группа - животные с карциносаркомой Walker256 при воздействии циклофосфаном (ЦФ) («Биохимик», Саранск, Россия); 3-я группа - животные с карциносаркомой Walker-256 при воздействии ме-латонином (МТ) (ICN Biomedicals Inc. USA). ЦФ вводили однократно из расчета 25 мг/кг внутрибрюшинно. МТ в дозе 0,3 мг/кг вводили внутри-брюшинно в течение 14 сут. Все манипуляции совершались, спустя 5 сут, с момента перевивки опухоли. Животных содержали при фиксированном световом режиме (свет - темнота 12:12). На светооптическом уровне исследовали образцы W256 на 3, 7 и 14 сутки, после воздействия цитостатиками. Для получения образцов опухоли крыс декапитировали под эфирным наркозом. Макроскопический анализ проводили с вычислением объема опухоли, размеры измеряли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях.
Полученные данные обрабатывали с использованием общепринятых методов статистики [2] на основании t-критерия Стьюдента для уровня достоверности 95% (p < 0,05).

Результаты и обсуждение. Согласно полученным данным, гисто-генетически W256 относится к опухолям молочной железы и является смешанной опухолью, образованной как саркоматозными (условно стромальными), так и эпителиоидными (условно паренхиматозными) компонентами; характеризуется инфильтративным ростом. Опухолевые клетки образовывали солидные комплексы, пласты и тяжи, которые внедрялись вдоль мышечных волокон и кровеносных сосудов, нарушая архитектонику и кровоснабжение скелетной мышцы.
В химиотерапии злокачественных опухолей применяются лекарственные средства, прежде всего направленные на необратимое повреждение клетки. Действия противоопухолевых цитостатических препаратов, реализуется путем индукции апоптоза [1]. Известно, что противоопухолевое действие ЦФ реализуется непосредственно в клетках опухолей, где приводит к нарушению жизнедеятельности этих клеток и блокированию их митотического деления. При воздействии ЦФ в опухолевом узле практически отсутствовали «светлые» клетки, основную массу составляли мелкие округлые или вытянутые клетки с гиперхромными ядрами. Сохранившиеся светлые клетки часто были многоядерными, обособлялись, цитоплазма их образовывала выросты; такие морфологические превращения клеток отражали их миграционную способность, т.е. способность к метастазированию. Опухоль содержала значительное количество тонкостенных сосудов капиллярного типа.
Через 14 сут происходила реверсия фенотипа опухоли, в ней опять преобладали «светлые» клетки. Отмечали варьирующие по размерам очаги некроза.
В настоящее время рассматриваются возможности иммунотерапии в онкологической практике, которая способствует восстановлению им-мунокомпетентости, повышению специфического противоопухолевого иммунитета, предупреждению иммунодепрессии. Учитывая присущие МТ его цитостатические, антиоксидантные свойства [5], его роль в механизмах апоптоза, представляет интерес для изучение МТ в качестве возможного модификатора канцерогенеза.
После воздействия МТ отмечалось усиление структурированности опухолевого узла, усиливающееся к 14 сут эксперимента: по периферии узла светлые клетки образовывали псевдофолликулярные структуры, в центре - преобладали более мономорфные клетки, среди которых располагались темные клетки, иногда образовывавшие тяжи. Опухоль была хорошо васкуляризирована; сосуды были полнокровными. В опухолевом узле регистрировались многочисленные мелкие очаги некроза.
При воздействии ЦФ с МТ отмечались выраженные некротические изменения опухолевых клеток: в одних зонах - диффузные, в других -очаговые; по периферии отмечался распад ткани. К 7-м суткам происходило значительное изменение строения и архитектоники опухолевого узла: в нем практически исчезали «светлые» клетки, значительная часть опухоли была представлена вытянутыми саркоматозными клетками, инфильтрирована лимфоцитами. Через 14 сут происходила реверсия фенотипа опухоли: опухолевый узел вновь был образован преимущественно «светлыми» клетками, которые образовывали псевдофолликулярные структуры, располагавшиеся по периферии, в центре опухоли -скопления мономорфных эозинофильных клеток с небольшими очагами некроза.
Анализ основных параметров опухолевого роста W256 показал, что прогрессивный рост карциносаркомы без лечения характеризовался достаточно высоким митотическим индексом (34,8±1,4%о) и низким апоптотическим индексом (0,7±0,2%). Снижение митотического индекса опухолевых клеток выявлено на всех сроках наблюдения после применения ЦФ и МТ. Апоптотический индекс увеличивался при всех видах использованных воздействий, но наиболее значительно он повышался в разные сроки при включении МТ. Через 7 и 14 сут - в группе ЦМ (в 11 и 5,7 раза соответственно).
Карциносаркома Walker 256 относится к модельным опухолям, обусловливающим развитие синдрома анорексии/кахексии, который, в свою очередь, ассоциирован с высокой смертностью в результате катаболизма белков скелетных мышц [4]. Уменьшение объема W256 было только при проведении терапии с включением ЦФ. При этом максимальное значение данный показатель отмечали при сочетанном воздействии ЦФ и МТ. При сочетании МТ с ЦФ величина показателя ТРО достигала максимальных значения.
Одним из системных проявлений неопластического потенциала является опухолевая кахексия. При «спонтанном» развитиии W256 масса тела крыс (без учета опухолевого узла) снижалась к 19-м суткам на 19%. При этом, мышечные волокна не только подвергались значительным ли-тическим повреждениям в опухолевом узле, но и активной инвазии опухолевых клеток в мышечные волокна с резорбцией саркоплазмы.
В группах, получавших ЦФ как моноагент, так и в сочетании с МТ, отмечали, что масса тела крыс снижалась по сравнению с контрольной группой всего лишь на 6 - 8%, что свидетельствовало об отсутствии потери мышечной массы.
Злокачественный рост характеризуется метастазирующим ростом клеток. При «спонтанном» развитии W256 к концу эксперимента возросла частота метастазов в подвздошные и паховые лимфатические узлы.
После воздействия МТ частота метастазов в лимфатических узлах выявлялись реже в 1,7 и 3,4 раза, чем при «спонтанном» развитии опухоли. При воздействии ЦФ метастазы выявлялись только на 14 сут. Со-четанное использование ЦФ с МТ приводило к полному отсутствию ме-тастазирования на протяжении всего эксперимента.

Выводы. Анализ основных параметров опухолевого роста карцино-саркомы Walker 256 (митотического индекса, интенсивности некроза и апоптоза, степени дифференцировки, метастатического потенциала) и системных проявлений неопластического процесса (неопластической кахексии) после изолированного и сочетанного применения циклофос-фана и мелатонина свидетельствует о том, что наибольшая эффективность терапии достигается при сочетанном применении химических агентов с разными механизмами действия.

Список литературы:
1.    Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста / Владимирская Е.Б., Масчан А.А., Румянцев А.Г // Гематол. трансфузиол. - 1997. - № 42. - С. 4-9.
2.    Медико-биологическая статистика / Гланц С. - М.: Практика, 1998. - 459 с.
3.    Динамика опухолевого роста у крыс линии Brattleboro и Wag при введении разных доз карциносаркомы Walker 256 / Хегай И.И., Попова Н.А., Ганилова Л.С. и др.// Бюл. экспер. биологии и медицины. - 2008. - Т. 145. - №1. - С. 88-90.
4.    Production of cachexia mediators by Walker 256 cells from ascitic tumors / Rebeca R., Bracht L. et al. // Cell. Biochem. Funct. - 2008.. - Vol. 26. - № 6. - P. 731 - 738.
5.    Melatonin rhithmicity: effect of age and Alzheimer's disease / Skene D.J., Swaab D.F. // Exp. Gerontol. - 2003. - Vol. 38. - № 1 - 2. - P. 199 - 206.