ВОССТАНОВЛЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА ПЕЧЕНИ РАСТИТЕЛЬНЫМИ ПОЛИФЕНОЛАМИ НА МОДЕЛИ CCL4-ГЕПАТИТА
Автор Кушнерова Н.Ф., Чижова Т.Л.
14.07.2009 г.
Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН
Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2006 год, Том 3, выпуск 1), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника
В результате массового образования свободных радикалов при попадании химического вещества в организм, активизируется процесс оксидативного разруше-ния липидов, белков и ДНК, ингибирование клеточной и антиоксидантной систем защиты, ряд других метаболических сдвигов, что вносит существенный вклад в патофизиологию заболеваний печени человека [2]. Поэтому применение растительных полифенолов - ловушек свободных радикалов - является одним из компо-нентов терапии при восстановлении функции печени после радикального повреждения ксенобиотиком.
Целью настоящей работы явилось изучение влияния растительного комплекса полифенолов препарата "Диприм" (свидетельство на товарный знак №197216), выделенного из винограда Амурского (Vitis amurensis) (патент RU № 1473139) в условиях экспериментального токсического гепатита у крыс, вызванного четы-реххлористым углеродом (ЧХУ).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Комплекс полифенолов (КПФ) выделяли из водно-спиртового экстракта из гребней винограда, полученного методом реперколяции. Измельченное сырье экст-рагировали 40% этанолом при соотношении сырья к экстрагенту 1:1. Полученный экстракт упаривали на роторном испарителе (t<35оС) для удаления спирта и центрифугировали для освобождения от осадка. Полученное водное извлечение наносили на колонку, заполненную Сефадексом LH-20 (800 х 28 мм) и уравнове-шенную дистиллированной водой (рН 5,5). Колонку элюировали 20% этанолом для удаления фенольных кислот и низкомолекулярных полифенолов, далее колон-ку промывали дистилированной водой (5 объемов колонки). В полученном препарате определяли содержание общих полифенолов [3]. Эксперимент проводили на крысах-самцах Вистар массой 130-180 г, содержавшихся на стандартном рационе питания. Крысам внутрижелудочно вводили 50% масляный раствор ЧХУ из расчета 1,25 мл/кг в течение четырех дней. Затем, после последнего дня введения ЧХУ перорально вводили водный раствор КПФ из диприма в дозе 100 мг/кг дважды в день в течение 7 дней. Животные были разделены на 4 группы по 8 крыс в каждой: 1-я - контроль (интактные); 2-я - введение ЧХУ; 3-я - введение ЧХУ в течение 4 дней с последующей отменой (депривация) в течение 7 дней; 4-я - введение КПФ в течение 7 дней после ЧХУ. Животные 3-й группы (депривация) после ЧХУ получали эквивалентное количество воды. Через 11 дней после начала эксперимента животных выводили из эксперимента декапитацией и определяли био-химические показатели в печени.
Экстракт общих липидов печени готовили традиционным методом. Фракционное разделение фосфолипидов (ФЛ) осуществляли методом двумерной тонкос-лойной хроматографии (ТСХ) [5]. Хроматографическое распределение нейтральных липидов (НЛ) и их количественное определение проводили методом одномер-ной тонкослойной хроматографии [1].Активность определяли с помощью специальных наборов Лахема (Чехия). Малоновый диальдегид (МДА), гексозы глико-протеидов и гексуроновые кислоты, активность маркерных ферментов лизосом -галактозидазы, -глюкозидазы и -глюкуронидазы определяли общепринятыми методами, активность АлАТ, УДФ-глюкуронилтрансферазы (УДФ-гтф) с помощью наборов "Биотест" (Чехия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Введение ЧХУ в течение четырех дней вызвало у животных типичную картину токсического гепатита с изменением биохимических показателей, характери-зующих уровень свободно-радикальных процессов в организме и обмен липидов в печени. Так, отмечалось двукратное увеличение содержания МДА (78,93,5 нмоль/г против 39,71,7 нмоль/г в контроле, P<0,001) в печени крыс, что свидетельствует о резкой активизации ПОЛ, инициируемом трихлорметилрадикалом (CCI3), образующимся в результате реакции ЧХУ и цитохрома Р450. Следствием этого является нарушение целостности структуры биологических мембран гепа-тоцитов. Данный факт подтверждается увеличением более чем в 20 раз активности АлАТ (34,2+-1,8 мкмоль/мл/час против 1,72+-0,09 мкмоль/мл/час в контроле, Р<0,001), являющейся ферментом-маркером цитолиза, а также мембран органелл, в связи с чем происходит выход лизосомальных ферментов в цитозоль. Увели-чивается активность лизосомальной -галактозидазы в 1,5 раза (P<0,01).. Снижение активности мембраносвязанного фермента -глюкозидазы на 32% (Р<0,05) и -глюкуронидазы на 47% (P<0,01) обусловлено нарушением структурной организации мембран лизосом радикалами CCI3. Активность СОД достоверно превыша-ла контрольный уровень в 4 раза, что определяет развитие оксидативного стресса в ответ на инактивацию радикалов CCI3 системой цитохрома Р-450. В печени нарушается система детоксикации, что выражается в снижении активности УДФ-гтф на 42% (P<0,001) и количества гексуроновых кислот на 35% (P<0,001). Как УДФ-гтф, так и гексуроновые кислоты необходимы для функционирования наиболее важной реакции второй фазы метаболизма ксенобиотиков - коньюгации их метаболитов с глюкуроновой кислотой. В спектре нейтральных липидов (табл. 1) отмечали увеличение содержания триацилглицерина (ТАГ), холестерина (ХС) и свободных жирных кислот (СЖК) в среднем на 20, 16 и 29%, соответственно (P<0,05-0,01). Одним из факторов повышения содержания ТАГ и СЖК является усиление периферического липолиза (стрессовая реакция на поступление ксенобиотика), в результате которого происходит выход жирных кислот и глицерина в печень из жировых депо с последующим их ресинтезом в ТАГ. Увеличение количества ХС обусловлено угнетением митохондриального окисления Ац-КоА в цикле Кребса.
Таблица 1.
Влияние растительного
комплекса полифенолов на содержание нейтральных липидов в печени крыс после
поражения четыреххлористым углеродом (в % от суммы фракций) (M±m)
Показатели
1 группа
Контроль
(интактные)
2 группа
ЧХУ
3 группа
Депривация
4 группа
Депривация
+КПФ
ФХ
43,15±0,84
38,23±0,65***
40,76±1,36
***43,26±0,56
ЛФХ
4,41±0,50
8,63±0,17***
6,30±0,62*
***4,05±0,34
СМ
11,00±0,43
16,12±0,23***
13,74±0,28*
11,76±0,57
ФЭ
22,01±0,45
18,98±0,43***
20,56±0,87
*22,17±0,76
ЛФЭ
2,68±0,19
5,40±0,66***
5,30±0,53*
***2,09±0,42
ФС
4,55±0,16
4,00±0,19*
3,75±0,12
***4,04±0,40
ФИ
5,00±0,10
4,38±0,11***
4,25±0,17***
****5,35±0,35
ФК
3,20±0,14
1,98±0,19***
1,86±0,38***
3,68±0,40
ДФГ
4,00±0,14
2,28±0,20***
3,48±0,14**
3,60±0,17
Примечание. Звездочки
справа - достоверные различия от контроля, слева - от 3-й группы. Одна звездочка
– Р<0,05; две – Р<0,01; три – Р<0,001.
Одновременно
происходило снижение этерифицированной формы указанных метаболитов: эфиров
холестерина (ЭХС) на 28% (Р<0,001) и эфиров жирных кислот (ЭЖК) на 18%
(Р<0,01). Такое соотношение липидных фракций свидетельствует о жировом
перерождении печени в связи с нарушением ее этерифицирующей функции.
Таблица 2.
Влияние растительного
комплекса полифенолов на содержание фракций фосфолипидов в печени крыс после
поражения четыреххлористым углеродом (в % от суммы фракций) (M±m)
Параметры
1 группа
Контроль
(интактные)
2 группа
ЧХУ
3 группа
Депривация
4 группа
Депривация
+КПФ
ТАГ
20,74±1,30
24,90±1,20*
24,40±1,10*
***19,35±0,48
СЖК
17,10±0,19
19,85±0,72**
20,90±1,19**
**16,81±0,42
ЭЖК
17,11±0,59
14,01±0,67**
14,10±0,34**
***20,91±0,50
ХС
16,18±1,16
20,83±0,45**
18,50±0,80*
**15,09±0,63
ЭХС
18,37±0,19
13,23±0,75***
15,10±0,76***
*17,15±0,54
Остаточная
фракция
10,50±0,50
7,18±0,23
7,00±0,18
10,69±0,53
Примечание. Звездочки
справа - достоверные различия от контроля, слева - от 3-й группы. Одна
звездочка – Р<0,05; две – Р<0,01; три – Р<0,001.
Изменения в фосфолипидном спектре (Табл. 2) сопровождались равнозначным увеличением в 2 раза содержания лизофосфатидилхолина (ЛФХ), лизофосфати-дилэтаноламина (ЛФЭ) (P<0,05-0,001), обусловленые активированием фосфолипаз. При этом наблюдалось достоверное снижение содержания основных структур-ных компонентов мембран: фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ) в среднем на 11-14% (Р<0,001). Известно, что при активации свободноради-кальных процессов в мембранах, в первую очередь подвергаются окислению полиненасыщенные жирные кислоты фосфатидов, что и вызывает уменьшение со-держания соответствующих фракций. Следует отметить достоверное уменьшение количества дифосфатидилглицерина (ДФГ) на 43% (Р<0,01) – основного фосфо-липида митохондрий, необходимого для функционирования ферментов дыхательной цепи. Уменьшение количества метаболически активных фракций фосфатиди-линозита (ФИ) и фосфатидилсерина (ФС) в среднем на 12% (Р<0,001), а также фосфатидной кислоты (ФК) на 38% (Р<0,001) предполагает угнетение активности мембраносвязанных транспортных АТФаз и синтеза фосфолипидов из ТАГ. Обращает на себя внимание увеличение уровня сфингомиелина (СМ) на 37% (Р<0,05), что является компенсаторной реакцией на повышение проницаемости мембран. Известно, что СМ увеличивает вязкость и жесткость мембраны, снижая ее прони-цаемость. Таким образом, ЧХУ оказывает непосредственное влияние на метаболические реакции в печени, что проявляется в формировании жировой инфильтра-ции, угнетении синтеза АТФ и фосфолипидов.
Через 7 дней после отмены ЧХУ (период депривации) в печени крыс большинство биохимических параметров не нормализовалось, более того отмечалось еще большее отклонение от нормы ряда биохимических показателей, что свидетельствует о недостаточности собственных защитных сил организма противостоять развитию токсической патологии. Сохранялось повышенное содержание МДА на 65% (65,1+-2,7 нмоль/г; P<0,001), указывающее на сохранение высокого уровня ПОЛ. Факт сохранения высокой активности СОД указывает на продолжение развития свободно-радикальных процессов. Это согласуется с увеличением активно-сти АлАТ в 2 раза по сравнению с контролем (3,38+-0,19 мкмоль/мл/час; Р<0,001). В спектре нейтральных липидов сохранялось повышенное содержание ТАГ, СЖК и ХС. Также отмечалось достоверно низкое содержание ЭХС и ЭЖК, то есть этерифицирующая функция печени была подавлена. Анализ фракционного состава фосфолипидов печени в период отмены ЧХУ (табл.2, 3-я группа) показал, что содержание ЛФХ и ЛФЭ осталось повышенным, что свидетельствует о дальнейшей активизации фосфолипаз. Кроме того, сохранялся высокий уровень СМ (на 25% выше контроля; P<0,05). Содержание основных структурных компо-нентов мембран – ФХ и ФЭ несколько возросло (на 8-9%) по сравнению с группой ЧХУ. Количество ДФГ, ФС, ФИ и ФК осталось на уровне таковых величин во 2-й группе. Таким образом, данные по анализу липидного спектра печени указывают на продолжение и углубление нарушений метаболических реакций даже в отсутствии токсического агента.
При введении животным КПФ из диприма в период отмены ЧХУ (4-я группа) отмечалась нормализация всех исследуемых биохимических показателей. Восста-новился антиоксидантный статус организма, что обусловливает благоприятные условия для реконструкции мембранных стркутур гепатоцитов. В пользу этого указывает снижение активности АлАТ в плазме крови до уровня интактного контроля (1,90+-0,14 мкмоль/мл/час). Исследование липидного обмена показало, что соотношение фракций нейтральных липидов в печени соответствует таковому у контрольных животных. Факт увеличения содержания ЭЖК и ЭХС после введе-ния КПФ указывает на восстановлении этерифицирующей функции печени. До контрольных значений снизилось количество ЛФХ и ЛФЭ при одновременном увеличении ФХ и ФЭ. Восстановилось соотношение метаболически активных фракций (ФК, ФИ, ФС, ДФГ). То есть, КПФ способствовал снятию токсического стресса, восстановлению функций митохондрий, синтезу фосфолипидов из ТАГ, снятию жировой инфильтрации печени.
Биохимический механизм восстановления функции печени с помощью КПФ, по нашему мнению, обусловлен их локализацией в пределах липидного бислоя плазматической мембраны [4], следствием чего и является снижение ее проницаемости. Все вышеизложенное определяет, что комплекс полифенолов из из греб-ней винограда, является эффективным препаратом, оказывающим выраженное гепатозащитное действие в условиях поражения печени четырехлористым углеро-дом. При этом основными факторами биологической активности являются антиоксидантное и мебраностабилизирующее действие, которое обусловлено прямым участием полифенолов в восстановительных процессах, протекающих более эффективно, чем в условиях обычной депривации.
Литература
1. Amenta J.S. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography. //J. Lipid Res. 1964. Vol. 5. N 2. P. 270-272.
2. Halliwell B., Gutteridge J.M. et al. Free radicals, antioxidants, and human disease: where are we now? //J. Lab. Clin. Med. 1992. Vol. 119. N 6. P. 598-620.
3. Singleton V.L., Orthofer R. et al. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent. //Oxidants and Antioxidants. Pt A.L.Packer. San Diego, Academic Press Inc. 1999. Vol. 299. P. 152-178.
4. Tsuchiya H. Effects of green tea catechins on membrane fluidity. //Pharmacology. 1999. Vol. 59. N 1. P. 34-44.
5. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y. et al. A universal reagent for phospholid analysis. //J. Chromatography. 1975. Vol. 114. N 1. P. 129-141.
Fatal error: require_once() [function.require]: Failed opening required '/home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/css/llm.php' (include_path='.:/usr/local/zend-5.2/share/pear') in /home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/bioinformatix/index.php on line 99
