Кафедра нормальной физиологии

Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 68-й научной итоговой студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г.Томск, 20-22 апреля, 2009 год); под реакцией академика РАМН В.В. Новицкого, член. корр. РАМН Л.М. Огородовой

Посмотреть титульный лист сборника

Скачать сборник целиком (1,5 мб)

 

Для достижения основной задачи сосудистой хирургии – восстановления целостности и функции сосуда - могут быть использованы разные методы. Но технологию получения «новых» сосудов на основе децеллюляризованных матриксов можно считать наиболее перспективной. Эта технология предполагает полное восстановление клеточного состава сосудистой стенки, и, следовательно, возобновления функционального состояния сосуда.
В многочисленных работах зарубежных авторов активно используется метод получения децеллюляризованных клапанов сердца свиньи для использования их в качестве трансплантата. Менее обширны исследования по децеллюляризации сосудов. Наше внимание привлекло исследование Roy et al. (2005) [1] по децеллюляризации сонной артерии свиньи. В этой работе была использована технология, включающая поэтапную обработку изолированного сосуда различными средами, а именно: гипотонической средой,  гипертонической средой с добавлением 1% тритона X-100, ферментативной средой (0,2 мг/мл ДНКазы и 20 мкг/мл РНКазы) и средой с 1% SDS. Хотя в результате была достигнута лишь частичная децеллюляризация сосуда, было показано сохранение свойств сосуда, таких, как например, упругость. Данная работа, как пример очистки сосудов, а так же ряд других работ по децеллюляризации различных органов и тканей [2] были учтены нами при разработке технологии получения децеллюляризованного матрикса.
Целью нашей работы является получение децеллюляризованной сосудистой стенки для дальнейшего использования в воссоздании структуры сосуда путем инкубации с культурой клеток.
Для получения сосудов в качестве объекта нами была выбрана аорта белых беспородных крыс массой 250-300г. У крысы, под эфирным наркозом, вскрывали грудную клетку, что вызывало пневмоторакс. Далее сердце и аорту освобождали от окружающих тканей. Затем сердце с отходящей аортой высвобождали, и этот органокомплекс помещали в PBS буфер (Phosphate Buffer Saline). После чего освобожденную аорту закрепляли на канюле перфузионной установки, где ее подвергали окончательной очистке от сопутствующих тканей, промывали в холодном PBS буфере в течение часа. В завершение данного этапа от аорты отрезали часть (0,5-1 см) для контроля. Оставшуюся часть сосуда обрабатывали различными растворами в несколько этапов (на каждом этапе отрезая часть сосуда на гистологическое исследование). Обработку проводили путем непрерывной перфузии при скорости 20 мл/мин, при комнатной температуре (20°C), за исключением растворов, содержащих ферменты (37°C).
Растворы, применявшиеся нами для децеллюляризации сосуда (по отдельности и в различных комбинациях):
1.    0,5% трипсин, 0,05% ЭДТА, рН 8,0
2.    0,05% трипсин, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ трис, рН 8,0
3.    5 мМ ЭДТА, 10 мМ трис, рН 8,0
4.    1 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ трис, рН 8,0
5.    1% тритон Х100, 5 мМ ЭДТА, 10 мМ трис, рН 8,8
6.    1% тритон Х100, 1 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ трис, рН 8,8
Образцы для гистологического исследования экспериментальной и контрольной групп фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине.
Срезы полученных образцов окрашивались гематоксилином и эозином, по Ван-Гизону, Пикро Маллори, толлуидиновым синим, реактивом Шиффа и азаном по Гейденгайну. Затем проводилось изучение строения сосудистой стенки на светооптическом уровне при увеличении до х400. Подсчет количества клеточных элементов в поле зрения (п/з) проводился по стандартной методике в 10 п/з при увеличении х400.
Нужно отметить, что в наших условиях суммарное время отмывки, используемое в других подобного рода работах (16-48 часов) оказалось неприемлемым. По-видимому, это связано с тем, что обычно используются крупные сосуды (свиньи, быка, человека), тогда как для  сосудов крысы не требуется столь длительной обработки. В связи с этим, суммарное время отмывки было уменьшено до 4-5 часов.
Анализируя изменения в строении сосудистой стенки при воздействии разных комбинаций растворов, мы пришли к следующим выводам:
1    Обработка низкой концентрацией трипсина и гипотонией (растворы 2 и 3) наиболее эффективна для удаления клеток эндотелия (при этом оставалось незначительное количество клеток адвентиции, структура стенки сосуда не претерпевала значительных изменений)
2    Использование гипертонических растворов (растворы 4 и 6) и ухудшает результат обработки, приводя к обширным деструкциям сосудистой стенки, что привело нас к отказу от их использования.
3    Наиболее эффективная децеллюляризация (до 64% в сравнении с контролем) при минимальном повреждении сосудистой стенки наблюдалась при применении раствора 1 не более 3х часов. Однако распределение клеток медии было неодинаковым (18-44 в п/з)
4    При обработке раствором 5 наблюдалось полное отсутствие клеток эндотелия и адвентиции, равномерное распределение клеток медии (около 47 клеток в п/з)
Исходя из данных результатов, можно заключить, что наиболее эффективной является последовательность обработки раствором 5 и раствором 1. При этом наблюдается полная отмывка эндотелия, 100% децеллюляризация адвентиции, значительное (до 67%) и равномерное снижение количества клеток медии. При этом сосудистая стенка значительно не изменяется.
Таким образом, наиболее эффективным в наших условиях оказалась обработка сосудов комбинацией трипсина, ЭДТА и детергента, что позволило уменьшить время обработки сосуда, повысить эффективность децеллюляризации при сохранении структуры сосудистой стенки.    

Список литературы:
1.    Roy S., Silacci P., Stergiopulos N. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model/ S. Roy., P. Silacci., N. Stergiopulos //Am J Physiol Heart Circ Physiol. – №289. C 1567-1576
2.    Gilbert T. W., Sellaro T. L., Badylaka S. F. Decellularization of tissues and organs /T. W.Gilbert, T. L.Sellaro, S. F. Badylaka// Biomaterials. – 2006. - №27 C .3675–3683