Товарищество с ограниченной ответственностью "Фармалекс" (г. Алматы)

 

Эта статья опубликована в сборнике научных статей с материалами XII Телеконференции с международным участием "Актуальные проблемы современной науки", Томск, 21-26 октября, 2013 год 

 

Современными методами исследования  доказано наличие в организмах живот-ных и человека неизвестного ранее, природного, иммунного механизма распознава-ния и уничто¬жения трансформированных клеток, который реализуется с участием комплемента и антител, направленных против клеточных рецепторов для связывания α-фето¬про¬те¬ина.

 

   THE  IMMUNOLOGICAL  ASPECTS  OF  CARCINOGENESIS

   Frantseva I.A., Frantsev A.P.

   By modern methods of investigation proved the presence in organisms of animals and humans previously unknown, natural, immune mechanism of recognition and destruction of transformed cells, which is implemented with the participation of complement and antibodies directed against cells with the receptors for binding of α-fetoprotein.

Общим признаком для клеток всех новообразо¬ва¬ний, как доброкачественных, так и злока¬чественных – является относительно высокая скорость их деления. Деление клет-ки, возможно только тогда, когда она накопит достаточное количество поли¬ненасы-щенных жирных кис¬лот (ПНЖК), необходимых ей для создания клеточных стенок до-чер¬ней клетки. Установлено, что при развитии зародыша, эмбриона и плода, репарации тканей, а также  при рос¬те клеток неко¬торых видов опухо¬лей, доставка ПНЖК к деля-щимся клеткам осуществляется α-фето¬про¬теином (АФП) [Абелев Г. И. 1970, Takayma H. 1995].

Для связывания АФП, нагруженного ПНЖК, на поверхности любых делящихся кле-ток им嬬ются специальные  рецепторы – РеАФП [В.А. Кирсанова  и др.2001]. Обычные клетки, редко вступающие в фазу деления,  имеют мବ¬лое количество РеАФП, или не имеют их вовсе. Ин¬тен¬сивно делящи¬е¬ся, опухолевые клет¬¬¬¬ки несут на своих поверхно-стях на порядки большее число таких рецеп¬то¬ров [С.Е. Северин и др. 2000, М.Б. Ни-цветов, и др.2005]. В настоящее время, РеАФП рассматриваются исследователями, как универсальный онко¬мар¬кер [В.А. Кирсанова и др. 2001]. 

В определенный период беременности, в сыворотке крови самок млекопитающих отмечается значитель¬ное увеличе¬ние содержания АФП [Cohen В. et all, 1973, Edeling C.I  et all 1977].  Доказано, что этот АФП – явля¬ет¬ся белком эм¬бри¬она, проникающим через плаценту в кровоток ма¬тери [В.А. Черешнев и др. 2004], где он обнаружи¬ва¬ется в достаточно высоких концентрациях [Houqhton D.I  et all. 1983], но иммунная система самки не вырабатывает антитела (Ат1АФП), с идиотипическими структурами Fab- фрагментов комплементарными к этому протеину. 

Отсутствие синтеза Ат1АФП воз¬можно в двух случаях – при полной структурной идентичности АФП эмбриона с АФП самки, что маловероятно, или - при избирательной суп¬рес¬сии синтеза антител к α-фетопротеину (Ат1АФП), антиидиоти¬пи¬ческими антителами к Ат1АФП, находящимися в сыворотке ее кро¬ви, которые наз¬ваются анти-идиотипичес¬кими антителами от АФП [Францев А.П и др. 2003] и могут быть обозна-чены как Ат2АФП.

  Доказано, что во многих случаях, антиидиотипические антитела способны не толь-ко проявлять иммунологические свойства, но и запускать в организме физиологические реакции, характерные для на¬тивного антигена, от которого они были получены. При-мером этому – могут служить антиидиотипические вакцины [Коростелев С.А. 2003].  Такие же свойства следует ожидать и от Ат2АФП. 

Структурная близость Ат2АФП с иммуноген¬ны¬ми сайтами АФП, предопределяет спо¬собность этих антител к взаимодействию с РеАФП клеток, так как эти антитела, по сути, являются иммунологиескими аналогами антител против РеАФП. Для которых уже найдено экспе¬рименталь¬ное под¬тверждение взаимодействия с РеАФП, как при изучении их специфичности, так и при практическом использовании подобных (Ат1РеАФП) антител [Северин С.Е  и др. 2000, Р. Д. Моро 1995].

Иммунологический надзор за делением и развитием клеток зародыша, осущест-вляется иммунной системой самки и начинается еще в среде маточного секрета, в ко-то¬ром сдер¬жатся комплемент, все виды антител и иммунокомпетентные клетки. В пост плацентар¬ный пе¬ри¬од, конт¬роль за правильным раз¬в謬тием клеток эмбриона и плода, осуществляют материн¬с¬кие им¬муноглобулины IgG типа, свобод¬но прони¬ка-ющие в кровоток эмбриона и плода через пла¬цен¬ту [Л. Йегер 1990, McNabb T et all, 1976, Dalakas M. C 1997]. Таким образом, только иммунная система самки способна распоз¬нать и уничтожить об¬разовавши¬е¬ся пато¬ло¬гические клетки у зародыша, эм-бриона, так как у них полностью отсутствует собственная иммунная система да¬же на позд¬них ста¬диях развития.

В свете этих данных, можно представить сформированный сотнями миллионами лет эво¬люции природный механизм, в котором Ат2АФП, распознают РеАФП любых, де-лящихся клеток и связываются с ними. В зависимости от плот¬ности на клеточной по-верх¬ности Ат2АФП, может про¬изойти  активация и сборка субъ¬единиц комплемента, что вызовет антите¬ло ком¬пле¬мент зависимый лизис любых клеток, имеющих высокую плотность РеАФП. 

Целью настоящей работы является доказательство определяющей роли  – иммуног-лобулинов Ат2АФП, а также комплемента, в борьбе с измененными клетками животных и человека.

Поставленная цель достигается путем выявления в экспериментах in vitro и in vivo цитотоксической активности Ат2АФП, выделенных из сыворотки пуповинной крови плода человека или из сыворотки молока коз, по отношению к различным видам опу-холевых клеток.

Материалы и методы

Антитела, способные взаимодействовать с поверхностными структурами опухоле-вых клеток (рецепторами, маркерами), выделяли из сыво¬ротки пуповинной крови плода человека, а также из сыворотки козьего молока. 

Для получения молочной сыворотки, молоко обезжиривали, а казеины створажива-ли добавлением небольшого количества лимонной кислоты. Для удаления частиц взвешенного казеина и других механических загрязнений, сыворотку молока центри-фугирова¬ли. 

Пуповинную кровь помещали в цилиндрический сосуд, где она свертывалась, обра-зуя сгусток. Сосуд со сгустком крови, помещали на 1,5 часа в термостат, при темпера-ту¬ре 37 ºС, для лучшего формирования сгустка и отделения его от сыворотки. Сыво-ротку крови сли¬ва¬ли и подвергали центрифугированию. 

В дальнейшем, как для сыворотки молока, так и для сыворотки крови, применяли од-ну и ту же схему фракционирования белков.

Первой стадией разделения белков обоих сывороток явилось фракционирование их суль¬фа¬том аммония. Фракцию белков, содержащую иммуноглобулины осаждали в диапазоне от 20% до 40% насыщения сывороток сульфатом аммония. 

Осадки белков (от 20 до 40% насыщения) сыворотки молока или сыворотки крови, перерастворяли в 0,9% растворе NaCl и наноси¬ли на колонку с Сефадексом G-50, урав-новешенную физиологическим раство¬ром, для отделения их от ионов сульфата аммо-ния и других низкомолекуляр¬ных компонентов.

Полученные элюаты белков, сывороток молока или крови, содержащие сумму им-муно¬глобулинов, ис¬поль¬зовали для избирательной сорбции их рецеп¬торами (маркера-ми) опухолевых кле¬ток.

Аффинную сорбцию белков сыворотки крови или молока, специ¬фич¬ных к поверх-ностным структурам клеток, проводили на троекратно отмытых 0,9% раствором хлори-стого нат¬рия мышиных клетках асцитной опу¬холи Эрлиха.

В суспензию клеток мышиной асцитной опухоли Эрлиха, вводили иммуноглобули-новую фракцию бел¬ков из сыворотки молока или сыворотки крови. Сосуды, содержа-щие смесь мы¬¬¬¬¬¬¬¬шиных кле¬ток асцитной опухоли Эрлиха с белками сыворотки крови или с белками сыворотки мо¬лока, помещали в термостат, где выдерживали при температуре 37 ºС, в течение 15 минут, при легком помешивании смеси, для лучшей сорбции им-муноглобулинов.  

 Суспензии клеток асцитной опухоли Эрлиха трижды отмывали от не сорбированных бел¬ков им¬муноглобулиновой фракции центрифугирова¬нием их в 0,9% растворе хлористого натрия при температуре 37 ºС. После отмывки от не¬ сор¬бирован¬ных белков сывороток крови или сыворотки моло¬ка, каждый из осадков клеток опухоли Эр¬лиха за-ливали небольшим объемом 0,4 М рас¬т¬во¬ра KCl, для десорбции протеинов, свя¬зан¬ных с поверхностными структурами клеток. 

После 15 минутной экспозиции в термостате при 37 ºС, обе суспензии мышиных клеток асцитной опухоли Эрлиха подвергали центрифугированию для отделения их от супернатантов.  KCl- супернатанты, с десорбированными белками сыворотки крови или сыворотки молока, под¬вергали диа¬лизу против 20 mM нат¬рий фосфатного буфера рН 7,0. 

Отделение IgG иммуноглобулинов от других классов антител и балластных белков, проводили с использованием колоночной аффинной хроматографии на рекомбинант-ной (E. coli) fast flow "протеин G сефарозы" фирмы "Serva", способной сорбировать толь¬¬ко иммуноглобулины IgG класса. Колонка с "протеин G сефарозой" пред¬ва¬ри-тельно уравновешивалась 20 mM нат¬рий фосфатным буфером рН 7,0, на которой и вы-полнялось аффинная хроматогафия согласно процедуре фирмы Роше [Roche 2009].  

Профиль элюции регистрировали при помощи проточного денситометра "2151 UV Vari¬able Wavelength Monitor" фирмы LKB (Швеция), при длине волны 280 нм  

Наличие  Ат2АФП, во фракциях IgG иммуноглобули¬нов сыворотки крови и сыво-ротки моло¬ка, полученных после сорбции их рецепторами опухолевых клеток и аф-финной хро¬ма¬тогра¬фии на колонке с "протеин G сефарозой", опреде¬ляли иммунофер-ментным методом, по способности их взаимодействовать с антителами пртив АФП (идиотип – антиидиотип вза¬имодействие). 

Работу выполняли на иммуноферментном анализаторе типа "ABBOTT  AxSYM", фирмы "Abbott Laboratories SA" (США), в ходе которой во фрак¬циях IgG иммуно-глобулинов, из сыворотки крови и из сыворотки молока, было отмечено присутствие " α-¬фетопротеина", хотя там его, не могло быть a priori. 

Это доказывает нали¬чие в имму¬ноглобулиновых фракциях из сывороток молока или сыворотки пуповинной крови антиидиотипических антител от α-фетопроте¬ина IgG типа, способных как к взаимодействию с клеточными рецеп¬торами опухолевых клеток, так и к проявлению некоторых иммунологических свойства, характерных для нативного АФП.

Цитотоксическое действие Ат2АФП на опухолевые клетки in vitro, определяли ис-пользуя феномен антитело-комплемент зависимой цитотоксичности, известный также, как реакция связывания комплемента (РСК). Объектами антитело-компле¬мент зависи-мого лизи¬са служили клетки крови здорового человека и клетки крови человека боль-ного лей¬козом. 

К инкубационной среде, содержащей лейкозные клетки и Ат2АФП, добав¬ля¬¬ли ком-пле¬мент. В качестве источника комплемента применяли растворенную в 0,9% рас¬творе NaCl сухую сыворотку крови морских свинок, используемую в РСК, при иммуно¬биоло-гических исследованиях, производства НПО " Микроген " ФГУП ¬(Им¬мунопрепарат) Россия. По окончании эксперимента, в поле зрения микроскопа, среди целых клеток крови, отмечались клетки, подвергнутые лизису.

В контрольных вариантах эксперимента, к инкубационной среде с опухолевыми клетка¬ми и Ат2АФП, добавляли указанный ранее раствор сыворотки крови морской свинки, пред¬варитель¬¬но прогретый до 60 ºС, в течение 30 минут, для тепловой инакти-вации компле¬мен¬та. В экспериментах с инактивированным комплементом лизиса опу-холевых клеток не от¬ме¬чалось.  

При аналогичных экспериментах с клетками крови здоровых людей – лизиса клеток не наблюдалось.

Проверку цитотоксического воздействия Ат2АФП на опухолевые клетки in vivo  проводили на индуцируемых асцитных и солидных опухолях мышей, крыс и спонтан-ных опухолях собак [Отчет Каз НИИ О и Р 2004]. В экс¬перимен¬те использовали мы-шиные клетки асцитной опухоли Эрлиха, а также тропные к легочной ткани клетки аффинитет¬ной опухоли яичников крыс (АфОЯ). Особенностью клеток АфОЯ является способность их образовывать множествен¬ные солидные опухоли в легких крыс. 

На фотографии № 1 показано действие Ат2АФП на клоны  опухолей клеток АфОЯ в легких крыс.       

Анализы крови крыс на активность комплемента, показали, что у большинства жи-вотных его активность значительно снижена. Так как лизис трансформированных кле-ток яв¬ля¬ется комплемент зависимым, то крысам, из другой экспериментальной группы, вводили экзогенный комплемент. В качестве экзогенного комплемента использовали раз¬веденную в физиологическом растворе сухую сыворотку морской свинки (Препарат Комплемент производства НПО " Микроген " ФГУП ¬Им¬мунопре¬парат Россия). Для контро¬ля влияния ком¬пл嬬мента на лизис опухолевых клеток, крысам из параллельной экспериментальной группы вводи¬ли сыворотку с инактивированным ком¬плементом. Результаты эксперимента с инактивиро¬ван¬ным комплементом не отличались от резуль-татов, полученных от применения Ат2АФП без экзогенного комплемента. 

На фрагменте фотографии № 1 - "Ат2АФП + комплемент" – видно, что легкие крыс практически полностью из¬бав¬ле¬ны от опухолей. Достичь такого результата удалось при одновременном введении животным Ат2АФП и экзогенного комплемента. До-биться полного освобождения легких крыс от опухолей возможно только при увеличе-нии длительности курса лечения крыс  Ат2АФП в комбинации с экзогенным компле-ментом [Г.С. Васильева и др. 2005].

Анализ имеющихся данных о наличии  РеАФП, на поверхности опухолевых клеток и взаимодействии с ними АФП [Проект МНТЦ 1878], а также антител против этих ре-цепторов (Ат1РеАФП) [Моисеенко В.М. 2003], предопределил логику данной работы. Было теоретически обосновано и экспериментально доказано наличие в организме жи-вотных и человека природного иммунного механизма распозна¬вания и уничтожения любых измененных клеток, с участием комплемента и ранее неизвестных науке Ат2АФП [A.P. Frantsev  et all, 2004], материнского происхождения.        

                                                       

Результаты исследований

Результаты, полученные в ходе выполнения данной работы, доказали, что в сыво-ротке молока и сыворотке крови млекопитающих  животных и человека присутствуют Ат2АФП – важнейший компонент естественного, природного иммунного механизма распознавания и уничтожения измененных клеток. В экспериментах in vitro, и  in vivo, доказан прин¬цип реализация этого механизма, с участием гуморальных факторов им-мунитета – материнских, по происхождению, антиидио¬типических антител от α-фето-протеина и ком¬племен¬та. 

Обнаружение материнских Ат2АФП в пуповинной крови указывает на активный перенос их через плаценту, а наличие их в сыворотке молока подтверждает присутст-вие их в других физиологических жидкостях организма.  

Эволюционная общность иммунных механизмов распознавания и уничто¬же¬ния из-менен¬ных клеток у млекопитающих, позволила использовать в работе Ат2АФП, ком-племент и опу¬¬холе¬вые клетки независимо от рода, вида и индивидуальных свойств до-норов или реципиентов. 

 

Обсуждение результатов

Полученные экспериментальные данные доказывают, что Ат2АФП – являются материнс¬кими, по происхождению, антителами IgG типа, так как эмбрион, не обладая собственной, функционирующей иммунной системой, не способен к синтезу каких либо антител. Обнаружение Ат2АФП в сыворотке пуповинной крови человека указы-вает на то, что эти антитела из сыворотки крови матери проходят через плаценту в кровь плода. Наличие Ат2АФП в сыворотке молока подтверждает известные факты присутствия антител в физиологических жидкостях организма. 

Все эти данные говорят о том, что иммунный контроль, над процессами канце-рогенеза, в клетках зародыша, эмбриона и плода осуществляется – иммунной систе-мой самки.

В работе использованы результаты доклини¬ческих исследований Ат2АФП, в каче-стве но¬вого противоопу¬холевого препарата, действие которого не ограничи¬вает¬ся ви-довыми и индивидуальными особенностями реципиентов, типом и локализацией опу-холевых клеток, проведенных на базе РГКП "Казахский республиканский научно ис-сле¬дова¬тельский институте онкологии и радиологии" МЗ РК.

 

Выводы 

Известно, что в организме, в норме, возникают сотни трансформированных клеток и дальнейшее их существование возможно только при нарушениях функционирования иммунной системы. К таким нарушениям надо отнести не только узкий спектр или низкий титр Ат2АФП, но и недостаточную активность или малое содержание компле-мента в крови. 

Низкий титр Ат2АФП, наследуется по женской линии (семейный рак), так как мать с низким содержанием или узким спектром таких антител в крови, не способна передать через плаценту их необходимое количество потомству.  Компоненты комплемента (субъединицы и факторы) синтезируются, в основном, в пече¬ни и болезненное состоя-ние этого органа (гепатиты, цирроз, интоксикации ) негативно сказывается на концен-трации и активности его в сыворотке крови. 

Рак – форма проявления функциональной недостаточности определенных звеньев иммунной системы организма. Присутствие в организме опухолевых клеток, являются смертельно опасным симптомов такого дефекта.

 Лечение опухолевых заболеваний должно быть направлено на восстанов¬ление за-щитных функций иммунной системы, а не только на борьбу с самими раковыми клет-ками.  В противном случае, неизбежны рецидивы опухолевых заболеваний, даже, после казалось бы, "успешного" лечения. 

Из результатов, полученных при выполнении данной работы - следует, что не гене-ти¬ческое наследование плодом некоторых элементов про¬тео¬ма матери (IgG иммуног-лобулины) в натальный период развития – является основным фак¬то¬ром, определяю-щим про¬тивоопухолевый статус организма потомства. Фактором, который, пока, никак не учитывается в исследованиях, связанных с канцерогенезом

 

Список использованной литературы

      1. Абелев Г. И. Эмбриональный сывороточный альфа-глобулин при злокачествен-ных опухолях  Вестник АМН СССР. 1970. Т. 25, № 7. С. 49–57.

      2. Takayma H. A case of bladder cancer producing alpha-fetoprotein (AFP). Hinyokika Kyio 1995; v 41, p 5, pp. 387-389.

      3. В.А. Кирсанова, Н.В. Маршутина, Н.С. Сергеева и др. Экспрессия рецептора альфа-фетопроте¬и¬на в некоторых нормальных и опухолевых тканях человека РФ, М, Вопросы биологии, медицины и фармацевтической химии 2001, № 1, стр. 14 -17.

       4. Северин С.Е., А.В. Родина,  М.Б. Ницветов, Е.Ю. Москалева, Г.А. Посыпанова, и др. "Изучение возможности использования моноклональных антител (МоАт) к ре-цептору Альфа-Фетопро¬теина (РеАФП) для регуляции противоопухолевого иммуни-тета"  Тезисы Второй Международной Ассамблеи "Новые медицинские технологии", 2000 г., Интернет выставка www.apteka-expo.ru 

      5. Ницветов М. Б., Москалева Е. Ю., Посыпанова Г. А., Макарова О. В., Степанов В. А., Рогов К. А., Коромыслова И. А., Караулов А. В., Северин С. Е.,. Изучение экс-прессии рецептора альфа-фетопротеина в опухолевых и нормальных тканях человека с помощью иммуногистохимического метода. РФ, Москва, Иммунология №2, 2005 г, стр. 10 – 12. 

       6. В.А. Кирсанова, Н.В. Маршутина, Н.С. Сергеева и др. Экспрессия рецептора альфа-фетопроте¬и¬на в некоторых нормальных и опухолевых тканях человека РФ, М, Вопросы биологии, медицины и фармацевтической химии 2001, № 1, стр. 14 -17.

        7. Cohen В., Graham H., Lorrin Lau H. Alpha-1 fetoprotein in pregnancy. Am J Obstet Gynecol 1973; v 115,   p. 7, pp.  881-883.

       8. Edeling C.I., Schioler V., Thisted I. Alpha-fetoprotein in cord serum correlated to gestationae age. Acta Obstet Gynecol Scand 1977; 56: I: 15-17.

       9. Черешнев В.А., Радионов С.Ю., Черкасов В.А., Малютина Н.Н., Орлов О.А. Альфа-фетопротеин Монография, Екатеринбург: УрО РАН, 2004 г., стр. 23.

     10. Houqhton D.I., Newnham I.P., Kitau M.I., Chard T. Short-term variation in the level of alpha-fetoprotein in maternal serum. Br J Obstet Gynecol 1983; v 90, p. 3, pp. 235-237.

     11. Францев А.П., Францева И.А., Медведева Е.М. Применение антиидиотипических антител к альфа-фетопротеину для избирательного комплемент-зави¬симого лизиса измененных клеток. Патент РК № 14142 от 11.07.2003 г.

     12. Коростелев С.А. ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва. «Противоопухо-левые вакцины»   Современная онкология № 4, 2003. стр 44 - 48.

     13. Северин С.Е., А.В. Родина,  М.Б. Ницветов, Е.Ю. Москалева, Г.А. Посыпанова, и др. "Изучение возможности использования моноклональных антител (МоАт) к ре-цептору Альфа-Фетопро¬теина (РеАФП) для регуляции противоопухолевого иммуни-тета"  Тезисы Второй Международной Ассамблеи "Новые медицинские технологии", 2000 г.

     14. Рикардо Дж. Моро  Обнаружение и лечение рака  Патент российской федерации RU 2161042 от 18.09.1995 г. 

     15. Сборник  Клиническая иммунология и аллергология под редакцией Л. Йегера, в трех томах, М., "Медицина", 1990, том 1, стр. 129.

     16. McNabb T., Koh T.Y., Dorrington K.J., Painter R.H.  Structure and function of im-munoglobulin domains. V. Binding of immunoglobulin G and fragments to placental mem-brane preparations.  J. Immunol. 1976, 117, pp. 882-888.

      17. Dalakas M. C. Intravenous immune globulin therapy for neurologic diseases.  Ann Intern Med., 1997, v.126, pp. 721-730.

      18. Protein A - Agarose & Protein G – Agarose. Affinity chromatography matrix for pu-rification of antibodies and for the immunoprecipitation of proteins. Roche, User manual, Version 14,0, December, 2009.

      19. Отчет по экспериментальным исследованиям противоопухолевой активности и токсичности нового иммунологического препарата "Нормоген" согласно договору ТОО "Real Med Compfny" и РГКП КазНИИ онкологии и радиологии г. Алматы, 2004 г. стр. - 25.

       20. Г.С. Васильева, И.А. Францева, А.П. Францев, В.К. Красноштанов, Т.Г. Гон-чарова, В.С. Толма¬чев, И.С. Подобед, М.Б. Лю, Т.А. Воронцова. Исследование дейст-вия Нормогена на метастатичес¬кую способность аффинитетной опухоли яичника (АфОЯ) крыс, обладающих тропностью к легоч¬ной ткани. Алматы, Р К, Онкология и радиология Казахстана. №2 (11), 2005 г, стр 27 – 31. 

       21. Проект МНТЦ 1878, Изучение избирательного АФП-индуцированного апоп-тоза раковых клеток: возможное приложение для моделирования антираковых препа-ратов. Руководитель Проекта Дудич Елена, E-mail: Этот e-mail защищен от спам-ботов. Для его просмотра в вашем браузере должна быть включена поддержка Java-script

       22. Моисеенко В.М. Моноклональные антитела в лечении злокачественных опу-холей РФ, М, Практическая онкология. Т.4, № 3, 2003 г, стр. 148 – 156.

       23. A.P. Frantsev, V.S. Tolmachev, I.A. Frantseva, E.M. Medvedeva  Use of antiiditipyc antibodies to alpha-fetoprotein for selective destruction of transformed cells. International Journal on Immunorehabilitation, Moscow, Russia, May 2004, Volume 6, Number 2, pp. 258.