|
*Тюменская государственная медицинская академия, **Тюменский научный центр СО РАН, г. Тюмень.
EFFECT OF BACILLUS SP. ON SURVIVAL OF MISGURNUS FOSSILIS L. EMBRYO, DEVELOPING FROM CALF LOW QUALITY
Enoktaeva O.V. ,* Kalenova L.F. ,** Subbotin A.M.**.
*Tyumen Medical Academy, Tyumen;
**Tyumen Research Center Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Tyumen
RESUME
Relevance. To improve the survival of juvenile fish can be used by the waste products of microorganisms. In particular, when a 30-second exposure of eggs with penicillin concentration 5000 I.U./ml was an increase in fertility of eggs, reducing the increase in malformations and embryo survival (Goryunova А.I., 1985). Earlier studies have shown that the metabolites of bacteria isolated from perennial permafrost Central Yakutia, capable of increasing the adaptive capacity of plants and mammals (Kalenova L.F., 2011). It is of interest to evaluate the effect of metabolic products of the strain on the viability of aquatic organisms.
The purpose of the study. Assess the impact of metabolites of microorganisms Bacillus sp. on the embryonic development of Misgurnus fossilis L.
Mature oocytes were obtained by injection of human chorionic gonadotropin were inseminated and incubated according to standard methods (Kostomarova А.А., 1975). Uniformity eggs in each series of experiments was provided by using a pair of calves of fish. Experiments were carried out with caviar low-quality embryo survival to the end of embryogenesis in the control was below 10%. For metabolites slurry of microbial cells at 1*106/ml were incubated water at -5°C for 72 hours and passed through filters «Millipore» with a pore diameter of 0.22 microns. Dining experience: Control 1 – semi-dry method of fertilization on Vrasskomu; Control 2 – before fertilization and sperm to eggs, water was added; Experiment 1 – adding metabolites to sperm before fertilization; Experiment 2 – adding metabolites to calf before fertilization; Experiment 3 – metabolites before fertilization added to both types of gametes. Eggs taken from female through 38 hours after intramuscular injection of 60 I.U. horiogonina and distributed by 100-170 eggs on the options in four replications. Milt was isolated at autopsy. As the fertilized eggs were added 40 ml of water and metabolites. Evaluated the degree of fertility of eggs, embryo viability, the sequence of passage stages of embryogenesis (in %). Statistical processing of data was performed in the program «SPSS 11.5 for Windows».
Results of the study. In addition to the metabolites, both types of gametes embryonic mortality was higher than in the controls throughout embryogenesis. Adding to the unfertilized eggs metabollitov not affect the dynamics of fertilization and passing stages of embryogenesis, and half raised embryo viability compared to the control by the end of the experiment. When adding metabolites to sperm fertilization of eggs increased by 15.9%, the number of live embryos by the end of embryogenesis relative to the control increased by 1.5 times.
Conclusion. These data indicate that the waste products of the bacteria Bacillus sp. can have a pronounced effect on the viability of aquatic organisms.
При искусственном воспроизводстве рыб происходит элиминация некоторой доли потомства, вызванная как природными факторами, так и биотехнологическими причинами [1]. Из выметанной во время нереста икры до взрослого состояния доживает лишь незначительный процент особей: например, у леща – всего 0,016-0,045%, у воблы – 0,012-0,015, у сазана лишь 0,042-0,085%. Из икры низкого качества все потомство погибает в раннем онтогенезе. Основная гибель эмбрионов происходит в критические периоды эмбриогенеза [2]. На рыбных фермах и в экспериментах для повышения выхода молодняка рыб используются различные способы воздействия на ранние стадии эмбриогенеза. Ведущими являются абиотические факторы: содержание в воде кислорода, углекислоты, аммиака и температуры воды, которые определяют результативность эмбрионального развития [3].
Хорошо зарекомендовали себя и биологически активные соединения. Положительное воздействие на ранний онтогенез рыб оказывают параамино-бензойная кислота (ПАБК) – генетически активное соединение, восстанавливающее первоначальную хромосомную структуру клетки [3, 4] и пенициллин [5].
Цель работы – оценить влияние продуктов метаболизма микроорганизмов Bacillus sp. штамма МG 8 на выживаемость эмбрионов вьюна, развивающихся из икры низкого качества.
Материалы и методы
Объектом исследования служил вьюн Misgurnus fossilis L. (н/отр. Теleostei, oтр. Суpriniformes, сем. Cobitidae). Зрелые яйцеклетки получали с помощью инъекций хорионического гонадотропина, осеменяли и инкубировали по стандартной методике Костомаровой А.А. [6]. Однородность икры в каждой серии опытов обеспечивалась использованием икры от одной пары производителей. Эксперименты проводились с икрой низкого качества: выживаемость эмбрионов к концу эмбриогенеза в контроле была ниже 10%. После оплодотворения икру инкубировали в отстойной воде при температуре 16-18.°С до начала вылупления предличинок. Прижизненные наблюдения за эмбрионами проводили с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа МБС-9 в лаборатории «Реконструкции биосистем» Тюменского государственного университета. Наблюдения за эмбрионами вьюна шли до 87 часа после оплодотворения, до момента вылупления первых предличинок. Процент живых особей считали от исходного количества икры каждого варианта. Анализировали стадии развития эмбрионов [6], синхронность развития эмбрионов, подсчитывали количество эмбрионов с отклонениями в развитии. Процент эмбрионов без отклонений в развитии и процент эмбрионов, находящихся на конкретной стадии развития, высчитывали от количества живых особей в варианте.
В качестве фактора воздействия на эмбриогенез рыб использовали продукты метаболизма (МБ) микроорганизмов Bacillus sp. штамм MG8, выделенных из многолетнемерзлых пород (Мамонтова гора, Центральная Якутия). Бактерии культивировали на агаризованной питательной среде ГРМ (производство: г. Оболенск) в течение 18-20 часов при температуре +20?С. Взвесь микробных клеток (м.кл.) смывали водой дистиллированной и определяли их концентрацию. Для получения продуктов метаболизма взвеси м.кл. инкубировали при –5°С в течение 72 часов и пропускали через фильтры «Millipore» (США) с O пор 0,22 мкм. Готовили 5 концентраций МБ: 1•106 (МБ-1), 10•106 (МБ-10), 50•106 (МБ-50), 125•106 (МБ-125) и 250•106 (МБ-250) м.кл./мл дистиллированной воды. Для выявления концентрации МБ, повышающей жизнеспособность эмбрионов вьюна, развивающихся из икры низкого качества, была проведена следующая серия опытов. Зрелые яйцеклетки получали с помощью инъекций хорионического гонадотропина, осеменяли и инкубировали по стандартной методике Костомаровой А.А. [6]. Икру, полученную от одной самки, раскладывали по вариантным чашкам Петри O 100 мм: контроль и пять опытных вариантов. В контроле перед оплодотворением к сперматозоидам добавляли 1 мл дистиллированной воды, в опытных вариантах – 1 мл МБ со-ответсвующей концентрации: МБ-1, МБ-10, МБ-50, МБ-125 и МБ-250. Воду и раствор МБ меняли ежедневно 3 раза в сутки. Эмбриогенез проходил при t = 16-18°С. В ходе эмбриогенеза учитывали количество оплодотворенной икры, синхронность развития эмбрионов и количество вылупившихся предличинок. Наилучшие результаты были получены при использовании метаболитов концентрацией 1•106 м.кл./мл дистиллированной воды, поэтому в дальнейших экспериментах использовали именно эту концентрацию.
Контроль 1 (Кс) – икру оплодотворяли полусухим методом по Врасскому, к сперматозоидам добавляли 1 мл воды дистиллированной на 30 с. перед оплодотворением. Контроль 2 (Ки/с) – к неоплодотворенной икре и спермиям добавляли по 1 мл воды дистиллированной на 30 с. перед оплодотворением.
Опыт 1 (Ос) – в сперму добавляли 1 мл МБ на 30 с. перед оплодотворением. Опыт 2 (Ои) – к неоплодотворенной икре добавляли 1 мл МБ на 30 с. перед оплодотворением. Опыт 3 (Ои/с) – к неоплодотворенной икре и спермиям добавляли по 1 мл МБ на 30 с. перед оплодотворением.
Эксперимент состоял из 2 серий опытов. Наблюдения велись до начала выхода предличинок из яйцевых оболочек. Количество икринок в каждом варианте зависело от продуктивности самки и изменялось от 300 до 600. Воду и раствор МБ меняли ежедневно.
Полученные данные по количеству живых эмбрионов обработаны стандартными статистическими методами с использованием программы Microsoft Exel. Системный статистический анализ проводили с использованием программы Statistica for Windows (Версия 6.0, StatSoft, Inc.). Достоверность различий распределения эмбрионов по стадиям определяли с помощью непараметрического критерия ? (лямбда) Колмогорова-Смирнова.
Результаты и их обсуждение.
Влияние МБ концентрацией 1•106 м.кл./мл дистиллированной воды на выживаемость эмбрионов вьюна при их добавлении к половым продуктам показано на рис. 1.
Рис. 1. Предобработка МБ гамет (Нормирование к контролю)
Проведенные опыты показали, что обработка МБ повлияла на качество половых продуктов и выживаемость эмбрионов. Процент оплодотворения икры был высоким во всех вариантах, но особенно следует отметить вариант Ос, где оплодотворяемость икры относительно контроля увеличилась на 15,9% и составила 82,3%, тогда как в Кс процент оплодотворения был 66,4%. В двух других вариантах опыта процент оплодотворяемости икры соответствовал контролю и составил в Ки/с – 74,6%, Ои – 79,4%. Ои/с – 70,2%.
В это время икринки имели следующий вид: в норме желточная оболочка отделилась от поверхности яйца, образовалось перивителлиновое пространство, цитоплазма собралась на анимальном полюсе икринки в виде цитоплазматического бугорка. По нему меридионально проходила борозда первого деления, образуя два бластомера. У единичных особей, как в контроле, так и в опытных вариантах, образовывались 4 бластомера. У неоплодотворенной икры цитоплазма равномерно распределялась вокруг желтка; такая икра вскоре погибала.
В зиготе и в развивающемся зародыше происходят процессы, от правильного завершения которых зависит последующее развитие. В оплодотворенной икре происходят изменения в обмене, так например, со стадии 2-4 бластомер у вьюна начинается синтез РНК, необходимый для гаструляции. В это время идет скрытая (внутренняя) дифференцировка, предшествующая явной морфологической и функциональной дифференцировке, которую наблюдается после стадии гаструляции [7].
Так же следует отметить, что в ходе онтогенеза время активации генов различно. Бывают как ранние гены, включающиеся уже в период дробления, так и поздние гены, транскрипция которых начинается относительно поздно, ближе ко времени формировании тканей и органов. При этом функциональное состояние ядер зависит от вида цитоплазмы, в которой находится ядро. Разная цитоплазма индуцирует разные функциональные состояния находящегося в нем ядра [8]. Можно предположить, что наличие МБ концентрацией 1•106 м.кл./мл дистиллированной воды в момент оплодотворения мобилизировала жизненные возможности вьюна на начальных стадиях развития в вариантах Ои и Ос, т.к. в этих вариантах количество живых эмбрионов было выше, чем в контроле на протяжении всего эмбриогенеза.
Большая устойчивость первых стадий связана с тем, что в цитоплазме яйцеклетки имеется все необходимое для прохождения стадий морулы и бластулы: два вида ДНК, три вида РНК, суммарное количество ДНК в несколько тысяч раз превышает гаплоидное. Цитоплазматическая ДНК является резервом, используемым во время дробления, так как синтез ядерной ДНК вновь образующихся клеток идет путем предварительного распада цитоплазматической ДНК. Поэтому раннее дробление может проходить даже при неблагоприятных условиях. Начиная со стадии гаструляции, процессы эмбриогенеза не обеспечены внутренним резервом яйца, поэтому их устойчивость к внешним факторам, меньше, чем устойчивость стадии дробления. Даже если стадия дробления будет завершена, у эмбрионов могут сформироваться отклонения в строении тела, что так же в дальнейшем повлечет их гибель. Но гибель, например, на стадии гаструляции свидетельствует не столько о ее чувствительности к факторам внешней среды, сколько указывает на невозможность прохождения стадии гаструляции, по-видимому, из-за глубоких нарушений, возникших в предшествующем периоде развития [7]. Изложенное выше прослеживается и в нашем эксперименте.
Добавление МБ к половым продуктам неоднозначно повлияло на выживаемость эмбрионов вьюна. В связи с этим первый пик различий по выживаемости эмбрионов между контролем и опытными вариантами приходится на 24 ч эмбриогенеза. На рис. 1 показано, что при учете нормирования к контролю максимальные различия по выживаемости эмбрионов наблюдаются между контролем и вариантом Ос (153 %), количество живых эмбрионов в варианте Ои было больше на 51,67%, чем в контроле, напротив, в варианте Ос/и на 51,7% было меньше, чем в контроле. Следует отметить, что в этот период во всех вариантах эмбрионы развивались синхронно и находились на 13-14 стадиях развития (гаструляция) (табл. 1). Второй пик различий по выживаемости эмбрионов наблюдался только между контролем и опытным вариантом Ос на 63 час эмбриогенеза. Возможной причиной этого является указанная выше активация генов, транскрипция которых начинается относительно поздно, ближе ко времени формировании тканей и органов.
Исходя из анализа данных, представленных в данной таблице, можно сказать, что асинхронное развитие эмбрионов начиналось с 42 часа эмбриогенеза и продолжалось до момента вылупления первых предличинок. В этот момент в варианте Ос произошла задержка в развитии и часть эмбрионов осталась на 14 стадии развития. Задержка в развитии начиная с 63 часа эмбриогенеза происходила во всех вариантах кроме Ои/с (табл. 1), так как в этом варианте наблюдалась максимальная гибель тех эмбрионов, которые по каким-то причинам отставали в развитии. На 87 час развития большая часть особей завершила эмбриогенез. Возможно из-за того, что у некоторых эмбрионов возникли отклонения в строении тела, они не смогли синхронно с остальными завершить эмбриогенез и покинуть яйцевые оболочки, и в дальнейшем большая часть из них погибла.
Заключение/обсуждение результатов.
В эксперименте использовались вьюны, выловленные из естественного водоема. В современных экологических условиях гидробионты в водоемах испытывают многочисленные деструктивные воздействия. В частности у рыб одним из видов нарушений является разрушение оболочек икры, еще находящейся в организме самок, то есть в периоды протоплазматического и трофоплазмотического роста. Яйцевые оболочки, в свою очередь, являются мембранами, которые играют важную роль во взаимоотношениях зародыша с окружающей средой [3]. Следует предположить, что одной из причин, повлиявшей на качество икры, была среда обитания производителей.
Необходимо также заметить, что положительное действие различных стимуляторов проявляется именно на икре низкого качества. Бурлаков А.Б. (1997) в своих опытах показал, что облучение светом гелий-неонового лазера (?=632,8 нм) неоплодотворенной икры значительно повышает выживаемость зародышей только плохого качества.
Такие авторы, как Бурлаков А.Б. (1997) и Селюков А.А. (2008) в качестве стимулирующего фактора для повышения жизнеспособности эмбрионов рыб используют физические воздействия, при этом экспозицию проводят только на неоплодотворенную икру, а не на сперматозоиды [9, 10]. Интересен тот факт, что обработка икры МБ так же повышает жизнеспособность эмбрионов, но наибольший положительный эффект наблюдается при обработке МБ только спермиев. Возможно, что после воздействия МБ на спермии выживаемость эмбрионов может увеличиваться по двум основным причинам: за счет изменения процента оплодотворения и вследствие определенной коррекции метаболитами эмбрионального развития, приводящей к сокращению количества аномально развивающихся зародышей в процессе эмбриогенеза.
Нежизнеспособные особи в контроле погибали постепенно на протяжении всего эмбриогенеза, в опытном варианте Ои/с при воздействии МБ на гаметы гибель нежизнеспособных эмбрионов происходила на более ранних стадиях развития. Это можно пронаблюдать на рис. 1, когда выживаемость эмбрионов в опытном варианте по сравнению с контролем была меньше с первых суток эмбриогенеза, но к моменту вылупления количество живых особей в опыте было чуть больше, чем в контроле (на 19%). Следует предположить, что предобработка МБ обоих типов гамет способствует ранней гибели нежизнеспособных эмбрионов.
Предобработка МБ неоплодотворенной икры не оказывала значимого влияния на оплодотворение и на динамику прохождения стадий эмбриогенеза, и почти на половину повысила жизнеспособность эмбрионов по сравнению с контролем к окончанию эксперимента, но, не смотря на это, через 87 часов после оплодотворения из всех живых особей только 46,67% завершили эмбриогенез, а остальные вскоре погибли.
У каждого органа есть свой критический период, во время которого его развитие может быть нарушено. Чувствительность различных органов к повреждающим воздействиям зависит от стадии эмбриогенеза. К физико-биологическим факторам, повышающих смертность эмбрионов рыб на более поздних стадиях развития некоторые исследователи связывают с «реализацией дефектов», полученных при прохождении предыдущих этапов развития [3]. В нашем опыте это проявляется в двух пиках различий по выживаемости эмбрионов между контролем и вариантом Ос. Предобработка МБ спермиев увеличила оплодотворяемость икры на 15,9%, и, несмотря на некоторую асинхронность прохождения стадий эмбриогенеза, учитывая нормирование к контролю, повысила количество живых эмбрионов к окончанию эмбриогенеза почти в 1,5 раза.
Вывод
При добавлении продуктов метаболизма микроорганизмов Bacillus sp. штамма МG 8 концентрацией 1•106 м.кл./мл дистиллированной воды к гаметам вьюна наиболее эффективным способом, повышающим выживаемость эмбрионов, развивающихся из икры низкого качества, является добавление метаболитов к сперматозоидам.
Литература
1. Горюнова В.Б., Шагаева В.Г., Никольская М.П. Анализ аномалий строения личинок и молоди осетровых рыб Волго-Каспийского бассейна в условиях искусственного воспроизводства // Вопросы ихтиологии. 2000. Т. 40. № 6. С. 804-809.
2. Макеева А. П. Эмбриология рыб. М.: МГУ, 1992. 216 с.
3. Мухачев И.С. Биологические основы рыбоводства: Учебное пособие. 2-е издание. Тюмень: Изд-во ТюмГУ, 2005. 300 с.
4. Сергиенко Л.Л. Вклад тобольской лаборатории в развитие рыбоводства в Тюменском регионе // Биология, биотехника разведения и состояние запасов сиговых рыб. Материалы седьмого научно-производственного совещания / Под ред. А.И. Литвиненко, Ю.С. Решетникова – Тюмень: ФГУП Госрыбцентр, 2010. 318 с.
5. Горюнова А.И., Богданович М.В. Влияние пенициллина на развивающуюся икру рыб при кратковременном его воздействии. Биологическая разнокачественность и рост некоторых видов сиговых и карповых рыб // Акедемия Наук СССР, Уральский научный центр, Институт экологии растений и животных. Свердловск, 1981. С. 38-45.
6. Костомарова А.А. Вьюн // Объекты биологии развития. М.: Наука, 1975. с. 308-323.
7. Данильченко О.П. Чувствительность эмбрионов рыб к действию токсических веществ // Вопросы ихтиологии. 1977. Т. 17. Вып. 3. С. 518-527.
8. Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития. Генетический аспект. – М.: МГУ, 2002 г. 264 с.
9. Бурлаков А.Б., Аверьянова О.В., Пащенко В.З., Тусов В.Б., Голиченков В.А. Лазерная коррекция эмбрионального развития вьюна // Вестник московского университета. Сер.16. Биология. 1997. № 1. С. 19-23.
10. Селюков А.Г., Солодилов А.И., Елькин В.П. Слабые взаимодействия и регомеостаз живых систем (прикладной аспект): Монография. Тюмень: Изд-во ТюмГУ, 2008. 192 с.
|
