Казахский государственный агротехнический университет им. С. Сейфуллина, г. Астана (Казахстан)

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2005 год, Том 2, выпуск 3), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Трихофития крупного рогатого скота является одной из актуальных проблем ветеринарной науки и практики. В Республике Казахстан это заболевание распространено повсеместно и наносит большой экономический ущерб, складывающийся из затрат на лечение, потерь продуктивности, снижения привесов, порчи кожевенного сырья. Трихофития, как зооантропонозная инфекция, представляет большую опасность для здоровья людей. По данным ФАО - Международной продовольственной сельскохозяйственной организации ООН, в 1971 г. трихофития была зарегистрирована в 113 странах мира /1/.
В 60-70-е годы прошлого столетия под руководством академика ВАСХНИИЛ А.Х. Саркисова проведены обширные исследования по изучению дерматофитии крупного рогатого скота, в результате которых создано эффективное средство специфической профилактики - вакцина ЛТФ-130. Однако, несмотря на применение вакцины, проблема трихофитии существует до сих пор. Причем, по последним данным трихофитию в настоящее время вызывает не только фавиформный трихофитон /2/. Следовательно, своевременная и дифференцированная диагностика заболевания позволит предотвратить перенос инфекции среди поголовья крупного рогатого скота, предупредит заражение людей.
Традиционная диагностика трихофитии включает в себя эпизоотологическое обследование, клинические исследования и лабораторный анализ. Лабораторная диагностика трихофитии состоит из нескольких моментов: микроскопия, выделение чистой культуры возбудителя, постановка биопробы, серологическая диагностика. Проведение этих исследований достаточно трудоемко, требует 10-30 суток. К трудностям лабораторной диагностики трихофитии относится: медленный рост возбудителя, морфологическое сходство с другими грибами-дерматофитами. Серологическая диагностика трихофитии также затруднена, т.к. общепринятые серологические реакции (РА, РСК) при дерматофитозах не обладают высокой специфичностью, для их постановки необходимо иметь специфические антигены /3/. В связи с этим раннее выявление больных животных в короткие сроки и диагностика скрытых форм заболевания трихофитией является актуальной задачей.
В настоящее время в развитии методов иммунологической диагностики инфекционных заболеваний наметилась тенденция на упрощение, стандартизацию иммунологического определения, попытки сделать его доступным для использования в любой диагностической лаборатории при проведении обследования большого количества образцов /4/. Одним из таких методов является иммуноферментный анализ. Метод иммуноферментного анализа универсален, обладает высокой специфичностью и чувствительностью, не требует сложного оборудования, и приемлем для проведения анализов в массовых количествах. Разработка методов получения характеризованных антигенов позволяет значительно увеличить специфичность методов ИФА и стандартизовать схему постановки реакции.
Антигенные свойства трихофитонов изучены недостаточно. В доступной литературе встречаются единичные сведения о химическом составе, структуре и антигенных свойствах клеточной стенки гриба Tr. faviforme. Так, А.Х. Саркисов с соавторами доказал, что способностью формировать иммунитет у крупного рогатого скота, лошадей, пушных зверей обладают алейрии трихофитонов (микроконидии) в стадии сапрофитного роста. По данным G. Muller (1976), Н.В. Касаткиной (1985) наиболее важные антигенные детерминанты локализуются на наружном слое клетки гриба, которая состоит в большинстве своем из полисахаридов /5/.
Отмечая, что носителем антигенных свойств является не клетка в целом, а ее полисахаридные и белковые компоненты, мы, в целях изыскания наиболее активного антигена, исследовали различные компоненты клеточной стенки гриба Tr. faviforme.
Нами получены компоненты клеточной стенки гриба Tr. faviforme: белковый, полисахаридно-липидный - ЛПС, липидный и полисахаридный, для чего были использованы различные методики /6/.
Наличие в ЛПС полисахаридного компонента, который к тому же является основной антигенной детерминантой, делает возможным его выделение методами, применяемыми для получения полисахаридов. Наиболее приемлемым, с нашей точки зрения, является метод, предложенный Westphal О. (1965) для получения из бактериальных клеток О-специфических антигенов. Различные авторы выделяли подобным методом полисахарилы бактерий рода Shigella, Pseudomonas, Proteus, Escherichia, Brucella, Vibrio, Yersinia и т.п. На сегодняшний день этот метод имеет множество модификаций: в частности, метод R. Diaz et al. (1979), метод Dobson G. et al. (1983), метод Кульшина В.А. с соавт. (1987), метод Красиковой И.Н. с соавт. (1998). Нами использовался метод Вестфаль О. в модификации, который позволил значительно увеличить выход ЛПС. Подобная модификация применялась ранее для получения антигена из микобактерий туберкулеза /7/. Модифицированный нами метод отличается применением для осаждения полисахаридов охлажденного до минус 60°С этанола с последующей экспозицией раствора при минус 60°С в течение 16–18 часов. Выход антигена составлял в среднем 53%.
Наши исследования по содержанию в препаратах ЛПС углеводов показали, что их содержание колеблется в широких пределах. При этом установлено, что концентрация углеводов выше в случае применения модифицированного нами метода фенольно-этанольной экстракции и составила в среднем 0,048 мг/мл или 0,005% от веса сырой массы мицелия. Выход антигена с 1 г сырой массы гриба составил 0,06%.
При получении полисахаридов методами гидролиза: в аутогидролизе, гидролизе концентрированной серной кислотой и мягком уксуснокислом гидролизе, выход полисахаридов из ЛПС по концентрации углеводов в исходных растворах составил 50,6 и 50%, соответственно.
Результаты экспериментов показали, что применение общепринятых методик нежелательно, так как обработка грибной массы приводит к загрязнению монокомпонентных антигенов примесями других веществ. Так, антиген, полученный по методу Буавена, содержит белка 0,175 ± 0,04 мг/мл, углеводов – 0,225 ± 0,04 мг/мл. Растворы ЛПС содержат примесей белка в среднем до 0,017 мг/мл, а растворы белка, соответственно, углеводов – 0,004 мг/мл.
В отношении наличия белка в ЛПС многие авторы считают, что его содержание колеблется до 1-2 % от сухой массы. Bartnicki-Garsia (1968) считает, что полностью освободить ЛПС от примесей белка невозможно, так как структурные белки прочно связаны с компонентами клеток. Набережных Г.А. с соавторами (1990) сообщали, что наряду с ЛПС ими выделен ЛПБК – липополисахарид-белковый комплекс, где в состав ЛПС входит белок. Результаты наших исследований показали, что наличие белка в препаратах ЛПС гриба Tr. faviforme составляет в среднем 5,6%, в растворах полисахаридов – до 1,2%. Наши данные по электрофоретическому разделению деградированного гидролизом ЛПС в 12% ПААГ подтверждают выводы других авторов о невозможности полного освобождения ЛПС трихофитонов от белка. При этом установлена возможность выявления структурного белка, входящего в состав ЛПС и ПС после окраски Кумасси голубым, используемым для окраски белков. Полосы белкового антигена и структурного белка полисахаридов находились на одном уровне, молекулярная масса их находится в пределах 65 КДа. Результаты исследований указывают на содержание в составе ЛПС белкового компонента, что позволяет сказать о получении иммунохимического аналога ЛПС с высоким содержанием белка, который скорее следует назвать липополисахаридно-белковым комплексом гриба Tr. faviforme – ЛПБК гриба Tr. faviforme.
Полученные антигены подвергали очистке. Использованные нами методы очистки антигенов позволили получить гомогенные препараты с минимальным наличием примеси. Гомогенность и однородность антигенов проверялась методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
По данным литературы состав и молекулярная масса ЛПС грамотрицательных микроорганизмов может быть самой различной. Встречаются сообщения о содержании в составе ЛПС бактерий высокомолекулярного гликолипида, высокомолекулярного глюкана, либо ЛПС с различной молекулярной массой. Молекулярная масса полученного нами препарата ЛПС находится в пределах 75 КД. Электрофоретический анализ ЛПС фавиформного трихофитона при окраске реактивом Шиффа показал, что препарат распределяется на пластинке в виде одной полосы шириной до 0,3 мм.
О возможности получения антигенов бактерий, очищенных от различных примесей, методом колоночной хроматографии на сефадексе G-50, сообщал Молотилов Б.А. (1986). В нашем случае, при очистке ЛПС на сефадексе G-50 нам не удалось фракционировать полисахариды на полисахариды О-специфических цепей и олигосахариды кора. Аналогичный результат получен Назаренко Е.Л. с соавт. (1987) при исследовании липополисахаридов Vibrio alginolyticus, а также Томшич С.В. с соавт. (1987) при исследовании ЛПС Yersinia enterocolitica. По мнению авторов, возможно, в процессе частичного гидролиза ЛПС не происходит расщепления связи между ними, либо они имеют близкие молекулярные массы.
В гель-фильтрационной хроматографии на сефадексе G-75 нам удалось фракционировать ЛПС и получить две фракции, каждая из которых содержала углеводы. Согласно литературным данным, первая фракция ЛПС грамотрицательных микроорганизмов, выделенная при проведении гель-фильтрационной хроматографии, содержит О-специфический антиген, вторая – олигосахаридные компоненты. Полученные нами результаты позволяют предположить, что в I фракции ЛПС содержится очищенный О-полисахаридный антиген. Это подтверждено в дальнейшем результатами ИФА и согласуется с многочисленными сообщениями других авторов о наличии в I-ой фракции серологически активного О-антигена. Так, титры антител, выявляемые неочищенным ЛПС, составили 1:5200 ± 0,34, I-ой хроматографической фракцией – 1:1300 ± 0,34, II-ой фракцией – 1:140 ± 0,34. Полученные данные свидетельствуют, что антигенная активность I-ой фракции уступает активности неочищенного ЛПС, хотя выявляет довольно высокие титры антител. Вторая хроматографическая фракция имеет слабые антигенные свойства. Другие авторы высказывали мнение, что антигены с молекулярной массой ниже 30 КДа являются иммунологическим балластом. Следовательно, активность антигенов зависит от показателей молекулярной массы, на что указывают проведенные эксперименты.
Метод хроматографической очистки белкового антигена выявил наличие двух белковых компонентов. Что характерно, как и в случае с ЛПС, белки I-ой фракции проявляли в дальнейшем большую активность, чем компоненты II-ой белковой фракции.  Молекулярная масса полученных нами белков при анализе методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН находилась в пределах 55 и 65 КДа, соответственно.
Как известно, молодняк крупного рогатого скота длительно неблагополучных хозяйств по трихофитии представляет реальную опасность в распространении инфекции в случае перегруппировок, выгоне животных на пастбища, массовых перемещениях скота при покупке или продаже. В этой связи исключительно важная роль принадлежит ранней диагностике заболевания, учитывая длительный инкубационный период при трихофитии и возможность заражения телят с 5-дневного возраста. Однако, обнаруживаемые классическими серологическими реакциями (РА, РП, РСК) антитела против трихофитии появляются в крови животного с развитием инфекционного процесса или через 1-2 месяца после проявления клинических признаков /8/. Это позволяет выявлять только тех животных, у которых инфекция приобрела острую или хроническую форму.
В общепринятых серологических реакциях титры антител при трихофитии регистрируются в разгар заболевания (РСК) или же через месяц после иммунизации или появления выраженных клинических признаков с последующим снижением их уровня через 6-8 месяцев (РА). Так, Маноян М.Г., при использовании в РА в качестве антигена 21-дневные культуры вакцинного штамма Tr. verrucosum шт. № 130, обнаруживала в сыворотках крови титры от 1:5 до 1:1280, а по данным И.И. Жаркова (1977) титры в РА составляли 1:80-1:320.
Изучение агглютинирующих свойств у цельных клеток гриба Tr. faviforme в РМА показало, что у кроликов обнаруживаются антитела против трихофитии в сыворотках крови в разведении 1:16 – 1: 128, у крупного рогатого скота – 1:2 – 1:512. Максимальные титры антител отмечали на 30-е сутки, которые снижались на 5-6 месяц, что согласуется с данными других авторов.
Нам не удалось изучить наличие комплементсвязывающих антител в сыворотке крови больных и вакцинированных животных. При постановке реакции РСК с сыворотками крови кроликов и крупного рогатого скота с использованием цельных клеток гриба и ЛПС отмечали феномен антикомплементарности. Это послужило причиной отказа от дальнейших исследований в этом направлении. С подобным явлением сталкивались и другие исследователи (Кокушина Т.М.,1967; Хамиев С.Х., 1991).
Преципитирующие свойства антигенов трихофитонов изучались ранее различными авторами. Некоторые исследователи сообщают о слабой преципитирующей активности и специфичности антигенов грибов. Другим удалось в достаточной мере изучить преципитирующие свойства полученных антигенов. При этом А.Н. Аспанидзе (1984) обнаруживал 1-3 нечеткие линии преципитации у метаболических антигенов, до 3 линий у белковых и 3-4 линии у полисахаридных антигенов. М.Г. Маноян (1991) выявила 5-7 линий преципитации в сыворотках крови кроликов, иммунизированных взвесью микроконидиев. Нам удалось выявить 1 нечеткую линию преципитации в случае иммунизации кроликов взвесью грибной массы в концентрации 10 ЕД по бактериальному оптическому стандарту мутности. При иммунизации животных препаратами белка и ЛПС не удалось установить наличие преципитирующих свойств у полученных антигенов. Подобные результаты дают возможность сделать предположение о слабой преципитирующей активности фавиформного трихофитона и её отсутствии у белковых и липополисахаридных антигенов. Гемагглютинирующие свойства выявлены у цельных клеток гриба Tr. faviforme, у полного антигена, полученного методом Буавену-Месробеану, и у белковых компонентов клеточной стенки гриба. ЛПС, ПС и липиды не обнаруживают гемагглютиногенных свойств. Возможно, именно белковая детерминанта обеспечивает гемагглютинирующие свойства цельной грибной клетки и полного антигена, а, находясь в комплексе с полисахаридами, белки усиливают свои гемагглютинирующие свойства.
Определение специфической активности сывороток крови мышей линии BALB/c, иммунизированных ЛПС, белком и вакциной ЛТФ-130, в ИФА, показало эффективность нашей схемы иммунизации. Оптимальная схема иммунизации, где последняя инъекция выполнялась за 3 дня до взятия крови, способствовала появлению достаточного количества сывороточных антител против антигенов гриба Tr. faviforme.
Выраженность гуморальных факторов иммунного ответа у животных предопределяет успех выявления антител в сыворотке крови с помощью серологических реакций /9/. Доза вводимого антигена зависит также от химической чистоты препарата, т.е. от его гомогенности. Как было сказано выше, полученные нами препараты антигенов характеризовались достаточной гомогенностью и однородностью. Иммунизация белых мышей проводилась ЛПС в дозе 0,01 мг/мл. Выбранная нами доза связана с высокой токсичностью и иммуногенностью препаратов ЛПС, о чем сообщали различные авторы и, что подтвердилось в наших исследованиях на белых мышах. Иммунизация белком и вакциной проводилась в дозе 0,01 мг/мл по содержанию белка в препарате антигена. Согласно полученным данным, ЛПС обладает достаточно высокими антигенными свойствами, что установлено посредством выявления антител в сыворотке крови иммунизированных животных.
Для постановки серологических реакций требуются сыворотки с высоким титром, получаемые путем иммунизации животных различными антигенами грибов. Нами отработана схема иммунизации кроликов обеспечивающая синтез антител в их организме в достаточно высоких титрах. Иммунизация животных по методу, предложенному учеными ВНИИБП (1964), индуцировала выработку антител в титрах до 1:128 в РМА. Использование других схем обеспечивал накопление антител в титрах 1:2 – 1:32.
Антигенные свойства ЛПС гриба Tr. faviforme изучались на поголовье молодняка крупного рогатого скота 1-8 месячного возраста. По результатам проведенных исследований нами отработана схема постановки непрямого варианта иммуноферментного анализа, основанного на использовании ЛПС в качестве антигена для обнаружения противотрихофитийных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота. По данным ряда исследователей, использование в серологических реакциях белковых антигенов позволяет преодолеть некоторые проблемы, связанные с применением ЛПС. Установлено, что последний способен неспецифически связываться с естественными IgM, что затрудняет интерпретацию положительных результатов. Кроме того, определенные сложности возникают из-за общности структуры полисахаридов трихофитонов разных видов. Отсюда следует, что более предпочтительным является использование белкового антигена, который выявляет только специфические антитела против трихофитии. Однако нашими исследованиями установлено, что процент выявления антител с применением ЛПС гриба Tr. faviforme более высок, чем при использовании белка. При этом с помощью ЛПС выявляются антитела в более высоких титрах. Если учесть сложность получения белков клеточной стенки, а также  простоту выделения и доступность реактивов для получения ЛПС, то налицо преимущества применения ЛПС в качестве диагностического препарата.
По сообщению Е. Кэбота (1968), недеградированный ЛПС многих видов бактерий почти полностью сохраняет специфичность О-антигена в реакциях с антисыворотками. “Деградированные” с помощью кислот гидролизом полисахариды обладают более низкой активностью, чем липополисахариды и интактные антигены. Это подтвердилось при изучении антигенных свойств полисахаридных компонентов клеточной стенки гриба Tr. faviforme, полученных методов гидролиза, в непрямом варианте ИФА. Так, ЛПС гриба Tr. faviforme в ИФА выявлял антитела в титрах 1:1130±0,63, а полисахариды, полученные методом уксуснокислого гидролиза - в титре 1:800 ± 0,63, полученные сернокислым гидролизом – 1:400 ± 0,34.
Варбанец Л.Д. с соавт. (1992) отмечали, что испытуемые сыворотки крови животных значительнее реагируют с ЛПС, чем с О-полисахаридом. По их мнению, это говорит о том, что антигенные детерминанты находятся не только в О-ПС, но и в других структурных компонентах молекулы ЛПС. У полисахаридов, полученных нами методом аутогидролиза, антигенные свойства были более выражены, чем у ЛПС и выявленные титры антител в сыворотках крови лабораторных животных составили в среднем 1:12800. Подобную активность препарата можно объяснить, по-видимому, более щадящим режимом гидролиза и частичным сохранением химических связей между полисахаридными компонентами и другими антигенными детерминантами ЛПС. Возможно, это приводит к сохранению антигенной детерминанты и освобождению от балластных примесей, что повышает активность и специфичность ЛПС. Хотя, следует отметить, что подобной активности антигена с сыворотками крови крупного рогатого скота, полученных от больных животных, не выявлено.
Таким образом, проведенные исследования позволили выявить наличие антигенных свойств у ЛПС и у очищенных полисахаридных компонентов, полученных как методами гидролиза, так и хроматографическими методами. Сравнивая результаты опытов, можно отметить, что наиболее активными антигенными свойствами в ИФА при выявлении противотрихофитийных антител обладают недеградированный ЛПС, а также полисахариды, полученные методом аутогидролиза.
Нами изучена специфичность ЛПС Tr. faviforme по сравнению с ЛПС сапрофитных грибов и ЛПС гриба Tr. sarkisovii. Результаты тестирования сывороток крови телят показали, что ЛПС фавиформного трихофитона в ИФА обладает большей активностью, чем ЛПС сапрофитной микофлоры. Однако разница результатов между данными по ЛПС грибов Tr. faviforme и Tr. sarkisovii незначительная. Подобные результаты можно было предвидеть, учитывая то, что до недавнего времени возбудителем трихофитии верблюдов считали Tr. faviforme, вследствие их близкого морфологического родства. Наличие перекрестной реакции между грибами другие авторы объясняют малой вариабельностью полисахаридов, входящих в состав клеточной стенки грибов.
Согласно литературным данным, дерматофиты не продуцируют экзотоксины, а ЛПС является эндотоксином. В культуральной жидкости нами не выявлено наличие антигенных детерминант, вступающих в реакцию со специфическими антителами.
Таким образом, исходя из данных, полученных при изучении специфичности ЛПС, можно сделать вывод об отсутствии перекрестной реакции между бактериальным антигеном и противотрихофитийными антителами. Между ЛПС Tr. faviforme и ЛПС Tr. sarkisovii и сапрофитов установлено наличие перекрестной реакции, хотя специфичность фавиформного ЛПС выше.
На сегодняшний день наиболее перспективным, удобным и высокочувствительным методом выявления антител против многих инфекционных заболеваний признан иммуноферментный анализ, т.к. с помощью этого теста можно обнаружить как полные, так и неполные антитела в крайне малых концентрациях. Полученные нами результаты серологических исследований зараженных, больных и иммунизированных животных в неблагополучных по трихофитии хозяйствах в РА и непрямом ТИФА также подтверждают высокую чувствительность иммуноферментного анализа. Эффективность иммуноферментного анализа в сравнении с классическими серологическими реакциями (РА) определена на 291 образцах сыворотки крови крупного рогатого скота из хозяйств, неблагополучных по трихофитии крупного рогатого скота. При исследовании крупного рогатого скота 1–2 месячного возраста нами была подтверждена возможность выявления противотрихофитийных антител непрямым вариантом твердофазного ИФА в сыворотке крови зараженных трихофитонами животных до проявления клинической картины. Так, при исследовании сывороток крови телят в РА во всех случаях был получен отрицательный результат. С помощью непрямого ТИФА в этих сыворотках обнаружено присутствие противотрихофитийных антител в 52,4 % случаев. Эти животные при дальнейшем наблюдении заболели поверхностной формой трихофитии. Высокая диагностическая ценность ТИФА, по нашему мнению, обусловлена высокой чувствительностью и специфичностью иммуноферментного анализа.
Также надо отметить преимущества ИФА в сравнении с РА при выявлении антител у животных с явной клинической картиной трихофитии. Постановку реакции агглютинации осуществляли в микроварианте. С помощью РМА антитела выявляли одновременно с проявлением клинических признаков. Появление антител в сыворотках крови регистрировали в твердофазном ИФА до проявления клинической картины заболевания в титрах 1:200-1:800. В то же время мы столкнулись с фактом наличия антител в незначительных титрах в ИФА при явно выраженной поверхностной трихофитии у теленка № 173. Возможно, данный феномен связан с особенностями течения заболевания, развитием процесса в поверхностных слоях кожи, отсутствием контакта клеток гриба с иммуннокомпетентными клетками, отвечающими за узнавание антигенов и стимуляцию процесса антителообразования.
При тестировании сывороток крови крупного рогатого скота непрямым вариантом ТИФА с целью обнаружения поствакцинальных противотрихофитийных антител у животных в возрасте 2-5 лет, выявлено их наличие у 86,7% животных в титрах 1:285 ± 0,13. У 13,3% поголовья обнаружить антитела не удалось. При тестировании этих сывороток в РА удалось выявить наличие антител у 37,5% животных в титрах 1:2 ± 0,16, у 62,5% животных антител не выявлено. Таким образом, из приведенных данных видно, что предлагаемая иммуноферментная тест-система обладала более высокой чувствительностью и специфичностью в сравнении с РА.
Результаты наших исследований свидетельствуют о возможности обнаружения антител в сыворотке крови больных животных методом иммуноферментного анализа задолго до проявления клинических признаков заболевания, в период проявления клинических признаков, длительное время после переболевания и вакцинации. Между показателями серологических реакций выявлена положительная корреляционная связь.
Таким образом, предлагаемая нами иммуноферментная тест-система на основе ЛПС клеточной стенки гриба Tr. faviforme достаточно эффективна для выявления специфических антител против трихофитии в сыворотке крови крупного рогатого скота. В ИФА удается выявить антитела, которые не обнаруживаются при использовании классических серологических реакций. Специфические антитела выявляются в инкубационный период, в период проявления клинических признаков, длительное время после переболевания и вакцинации.
На основании анализа вышеприведенных результатов исследований можно заключить, что непрямой вариант иммуноферментного анализа в сравнении с РА является более специфическим и эффективным тестом, и может быть использован как экспресс метод при диагностике трихофитии крупного рогатого скота с целью обнаружения антител против трихофитии у зараженных, больных, переболевших и вакцинированных животных. Иммуноферментная тест-система позволяет обнаруживать антитела против возбудителя трихофитии крупного рогатого скота в инкубационный период заболевания и отличается от РА более чем в 2 раза высокой чувствительностью.
По результатам исследований разработана иммуноферментная тест-система на основе использования ЛПС гриба Tr. faviforme для обнаружения антител к данному компоненту в сыворотке крови белых мышей и крупного рогатого скота и разработаны «Методические указания по иммуноферментной диагностике трихофитии крупного рогатого скота», утвержденные научно-техническим советом по ветеринарии МСХ Республики Казахстан.

Использованная литература
1.    Саркисов А.Х. Иммунитет и специфическая профилактика дерматомикозов животных. // Труды ВИЭВ. - Т. 65. - Москва. - 1987. - С. 3 - 17.
2.    Иванова Л.Г. Возбудители дерматомикозов животных. // Бюлл. ВИЭВ. – Вып. 54. – Москва. – 1984. – С. 9-11.
3.    Хамиев С.Х. Трихофития верблюдов. Диссерт. … докт. вет. наук. Алма-Ата. 1991. С. 45, 165.
4.    Белоусов В.И., Гусев А.А. Актуальные проблемы лабораторной диагностики заразных болезней животных. // Ветеринария. – 1999. - № 7. – С. 3-6.
5.    Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. Москва. Наука. 1983. С. 5-54, 70-203.
6.    Терешина В.М. Сравнительное изучение структуры и компонентов клеточной стенки грибов семейства Choanephoraceae в процессе дифференциации. Автореф. дисс. … канд. биол. наук. Москва. 1983.
7.    Булашев А.К., Муканов К.К., Шенжанов К.Т., Сейткасымов Б.К. Технология получения клеточно-ассоциированного поверхностного липополисахаридного антигена  микобактерий бычьего туберкулеза и исследование его активности в иммуноферментном анализе. // Мат. межд. научн. - практ. семинара. – Степногорск. - 1998. - С. 25-26.
8.    Макарченко В.А. Препарат ТФ-130 – эффективное средство против стригущего лишая. // Бюлл. ВИЭВ. – 1972. – В. 12. – С. 48-49.
9.    Оспанова С.Г. Получение моноклональных антител к адгезивному антигену К 88 E. Сoli и разработка на их основе диагностической тест-системы. Дисс. … канд. биол. наук. Астана. 1999. С. 21-23.