Введение Исходя из важности транскетолазы (ТК) в обменных процессах, понимание механизма ее действия и регуляции на молекулярном уровне представляет большой интерес. ТК— фермент, контролирующий неокислительную ветвь пентозофосфатного пути превращения углеводов, катализирует обратимый перенос двууглеродного фрагмента с кетозы на альдозу [1]. В гепатоците 1/3 глюкозы окисляется по этому пути, он наиболее активен в лактирующей молочной железе, жировой ткани и лейкоцитах. В эритроцитах пентозофосфатный путь является источником NADFH+H+, использующегося для восстановления окисленного глутатиона. Таким образом, в эритроците существует мощная антиоксидантная ферментная система, предотвращающая перекисную деструкцию его цитоплазматической мембраны. Гормональный контроль осуществляет инсулин через стимуляцию ТК [2]. Моделью для изучения кинетических характеристик в наших исследованиях явилась ТК saccharomyces cerevisia. Это гомодимер, состоящий из двух эквивалентных каталитически активных субъединиц. Кофакторами ТК являются ионы двухвалентных металлов и тиаминдифосфат [1]. Кроме классической двусубстратной реакции, ТК способна катализировать и односубстратную с ксилулозо-5-фосфатом (Х-5-Р) в качестве субстрата. Целью работы было определение константы сродства субстрата-донора Х-5-Р ТК (константы Михаэлиса-Ментен— Km) в односубстратной реакции с Mg2+ и Са2+ в качестве кофакторов. И то же самое для полухолоТК с работающими только первыми или вторыми активными центрами.
Материалы и методы Измерения проводились на спектрофотометре AMINCO DW-2000. Активность ТК определяли по скорости образования восстановленного NAD в системе сопряженных реакций с глицеральдигидфосфатдегидрогеназой в качестве вспомогательного фермента.
Результаты и обсуждение Впервые показано, что для холоТК в односубстратной реакции в присутствии как Mg2+ , так и Са2+ имеют место три константы сродства к Х-5-Р. Тогда как в двусубстратной реакции таких Km в каждом случае по одной, и зависимость скорости реакции от концентрации субстрата имеет гиперболический характер. Рассчитаны Km для односубстратной реакции с Mg2+ и Са2+; выявлена четкая S-образность на участке от 400 до 650 мкмолей (в реакции с Са2+). Делано предположение, что второе плато обусловлено работой двух активных центров ТК. Для проверки этой гипотезы, методом спектрофотометрического титрования по активности тиаминдифосфатом и окситиаминдифосфатом были получены полухолоТК с работающими только первыми или вторыми, соответственно, активными центрами. В первом случае исчезает третья константа, причем две первых остаются практически без изменений. Во втором снижается скорость реакции, исчезает первая константа и S-образность, а насыщение происходит гораздо позднее, чем при двух работающих центрах.
Заключение Экспериментальный материал, на основе которого получены зависимости представляет большой интерес с точки зрения как фундаментальной науки, так и медицины. Все данные являются новыми и получены впервые, для их интерпретации требуются дальнейшие исследования в этой области.