В настоящее время в широкой практике лабораторной диагностики клещевого энцефалита (КЭ) применяют иммуноферментный метод (ИФА) и реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) для индикации антигена вируса и ряд тестов для выявления антител к возбудителю. Все эти методы занимают достаточно много времени, требуют специального оборудования и высокозатратны. Известно, что экстренная профилактика КЭ иммуноглобулином может быть эффективна только в первые часы после инфицирования, в остальные сроки ее эффективность значительно снижается, то-есть появляется большая возможность развития заболевания. Поэтому для эффективной диагностики КЭ необходим экспресс-метод, который бы позволил быстро провести индикацию возбудителя. Таким тестом является реакция коагглютинации (РКОА), которая позволяет произвести анализ материала в течение нескольких минут.
Целью настоящей работы явилась разработка биореагента для принципиально нового теста экспресс-диагностики клещевого энцефалита.
Всего приготовлено 11 экспериментальных серий препарата, прошедших лабораторное изучение на специфичность и чувствительность. Для определения специфичности коагглютинирующего реагента при выявлении антигена вируса КЭ в РКОА титровали материал, содержащий (К+) и не содержащий (К-) антиген вируса КЭ.
Для определения чувствительности РКОА титровали материал, содержащий антиген вируса КЭ, тремя способами: РКОА, ИФА и РНГА. Исследуемым материалом служила вакцина КЭ на разных стадиях технологического процесса. Чувствительность определяли степенью разведения исследуемого материала (титра в абс. ед) и количеством белка Е, определяемом в данном разведении (в нг).
Проведено испытание препарата на природном (280 клещей снятых с людей) и клиническом материале: исследовано 215 сывороток крови инфицированных людей, 408 сывороток крови больных в острой форме и 65 сывороток крови больных в хронической форме заболевания клещевым энцефалитом.
Антиген вируса КЭ в клещах выявляли одновременно методом РКОА и ИФА, сыворотки крови больных КЭ изучали одновременно в РКОА, РНГА и ИФА. Работу проводили на базе и совместно с сотрудниками вирусологической лаборатории ГСЭН в Томской области в эпидсезон 2003 года. Исследование сывороток крови больных с хроническим течением заболевания проводили на протяжении всего 2003 года (материал также исследовали совместно с сотрудниками вирусологической лаборатории ГСЭН).
Для ИФА и РНГА использовали коммерческие наборы препаратов, производства предприятия ФГУП
НПО "Вирион".
Контрольной группой для изучения специфичности РКОА явились 103 здоровых беременных женщин, обследовавшиеся в плановом порядке в течение беременности в Центре перинатальных инфекций. Кровь контрольной группы нам любезно представлял заведующий центром канд. мед. наук С. Ю. Юрьев.
Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с вычислением средних величин, среднеквадратичного отклонения, ошибки средней. Критерий достоверности различий (р) определяли по таблицам Стьюдента-Фишера. Различия считали достоверными при р<0,05.
Лабораторное изучение специфичности РКОА показало, что этот тест, выполненный с помощью созданного нами коагглютинирующего реагента, является специфичным, т.е. реакция была положительной при исследовании материала, содержащего антиген вируса КЭ (К+) и отрицательной при исследовании материала не содержащего антигена вируса КЭ (К-). РКОА по количеству выявленного антигена вируса КЭ и минимальному количеству белка Е во много раз чувствительнее РНГА и в среднем в 2-4 раза чувствительнее
ИФА.
Изучение природного материала (клещи, снятые с людей) в эпидсезон 2003 г. также убедительно подтвердило более высокую чувствительность и специфичность РКОА по сравнению с ИФА. Чувствительность определяли по количеству выявленных положительных результатов в той или иной реакции и по отношению всех исследованных клещей. Так, чувствительность РКОА при выявлении антигена вируса КЭ в клещах по общим результатам была 26,1 ± 2,6%, в ИФА - 15,0 ± 2,1% (разница достоверна, р<0,05). Специфичность определяли по количеству положительных результатов в той или иной реакции в отношении ко всем положительным результатам. Так, специфичность РКОА составляла в среднем 72,2 ± 4,4 %, ИФА - 41,6 ± 4,9 % ( разница достоверна, р<0,05).
При применении двух реакций (ИФА и РКОА) антиген вируса КЭ в клещах был выявлен в 36,0 ± 2,8 %, в то время как при применении только одного метода ИФА он выявлен в 15,0 ± 2,1 %, т.е. диагностическая эффективность повышается в 2,4 раза. При исследовании сывороток крови инфицированных людей, больных в острой и хронической формах заболевания клещевым энцефалитом была установлена разная степень выявления AgВКЭ. Так, у инфицированных людей, обследованных в основном в первые два дня после укуса клеща, антиген вируса КЭ был выявлен лишь у 35,4 ± 3,2 %, в то время, как у больных в острой форме заболевания - 65,7 ± 2,3 %, у больных с хроническим течением - 72,3 ± 5,5% ( разница достоверна р<0,05). Причем в группе инфицированных в ИФА AgВКЭ выявлен чаще, чем РКОА и РНГА (разница не достоверна); у больных с острым течением наибольшее выявление было в РКОА по сравнению с РНГА и ИФА (разница в обоих случаях достоверна р<0,05); у больных с хроническим течением заболевания AgВКЭ выявляли также чаще в РКОА, чем в ИФА и РНГА (разница достоверна между РКОА и ИФА, р<0,05).
Итак, из представленного материала можно сделать следующее заключение, что разработанный нами коагглютинирующий реагент позволяет проводить экспресс-диагностику клещевого энцефалита в РКОА. Лабораторная апробация препарата показала, что РКОА является чувствительным и специфичным тестом (во много раз чувствительнее РНГА и в 2-4 раз чувствительнее ИФА). Проведенные испытания РКОА на природном и клиническом материалах подтвердили высокую чувствительность и специфичность этого теста.
Комплексное применение РКОА и ИФА при исследовании клещей на содержание в них антигена вируса клещевого энцефалита позволяет повысить диагностическую эффективность в 2,4 раза.
Клиническое испытание показало, что РКОА может быть применена для выявления антигена вируса клещевого энцефалита у инфицированных и у больных клещевым энцефалитом в острой и хронической формах. Комплексное применение РКОА, РНГА и ИФА для выявления антигена вируса клещевого энцефалита и ИФА для выявления специфических IgM и IgG позволяет повысить эффективность диагностики клещевого энцефалита до 82,4 % у больных в острой форме и до 86,5% у больных с хроническим течением заболевания.
Диагностические тесты РКОА, ИФА и РНГА не исключают, а дополняют друг друга и должны применяться в комплексе для диагностики клещевого энцефалита у больных людей.