Не вызывает сомнения присутствие в гладкомышечных клетках (ГМК) Na+,K+,2ClI- котранспорта и хлорной проводимости мембраны [7,8,10], интерес к которым в последнее время стал особенно пристальным из-за предполагаемого участия не только в объем-зависимых [3,8-9], но и в сократительных ответах при действии биологически активных веществ (БАВ) и нитросоединений [3-5,9]. В этой связи, механизмы влияния Na+,K+,2ClI- котранспорта на развитие процессов электрогенеза в ГМК начинают интенсивно исследоваться [2] и предполагается, что одной из эффекторных систем котранспорта являются хлорная проводимость мембраны.
Цель: Изучить роль хлорной проводимости мембраны в регуляции сократительной и электрической активности гладкомышечных клеток мочеточника морской
свинки.
Методика: Объектом исследования служили изолированные гладкомышечные сегменты мочеточника морской свинки длиной 10-12 мм. Для одновременной регистрации вызванных электрическим стимулом потенциалов действия (ПД) и сокращений гладкомышечных клеток (ГМК) использовалась методика двойного сахарозного моста [1,2]. Регистрацию ПД проводили с помощью неполяризуемых электродов, сократительной активности - с использованием механотрона 6МХ2Б в условиях, близких к изометрическим. Параметры электрической и сократительной активности ГМК после усилителя электрических сигналов подавались на АЦП и регистрировались с помощью
IBM PC.
Используемые растворы и реактивы: 1.Раствор Кребса (мМ): NaCl-133; KCl-5,0; MgCl2-1,2; NaH2PO4 -1,2; CaCl2-2,5; трис(гидроксиметил)-аминометана-15; глюкозы-11,5; рН-7,35. 2.Безнатриевый раствор с эквимолярным замещением NaCl на холинхлорид. 3.Тестирующие растворы приготовлялись добавлением в раствор Кребса соответствующих реактивов: гистамина, мезатона, сахарозы (все - Реахим, Россия), нитропруссида натрия и буметанида (Sigma), тетраэтиламмония хлорида, нифлумовой кислоты и SITS (Serva). Температуру растворов поддерживали на уровне 36,8-37 С.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. В качестве контрольных (100%) принимали значения амплитуды анэлектротонического потенциала (АЭП), параметров потенциала действия (амплитуда пиковых компонент и длительность плато) и амплитуды сокращения в растворе Кребса, либо тестирующих веществ в ответ на электрический стимул.
Результаты. Ранее нами было показано, что ингибитор Na+,K+,2ClI- котранспорта буметанид (10 мкМ) вызывал гиперполяризацию мембраны и снижал силу сокращений ГМК мочеточника до 83.5±11.7% (n=9, p<0.01) от контрольных значений, тогда как в более высоких концентрациях (50-100 мкМ) его угнетающий эффект исчезал. На фоне мезатона (10 мкМ), гистамина (10 мкМ), нитропруссида натрия (10 мкМ), тетраэтиламмония (ТЭА, 5 мМ) и в безнатриевых растворах угнетающий эффект буметанида усиливался и приобретал дозозависимый характер [2]. Было предположено, что используемые БАВ участвуют в активации Na+,K+,2ClI- котранспорта ГМК.
 
Другим известным способом активации Na+,K+,2ClI- котранспорта является гиперосмотическая среда [3,8-9]. Добавление 150 мМ сахарозы к раствору Кребса привело к снижению сокращения до 65±10.1% (n=7, p<0.05) от контрольных значений на фоне деполяризации мембраны при незначительном увеличении мышечного тонуса. (Рис.1А,Б).
Если предположить, что угнетение Na+,K+,2ClI- котранспорта может снижать процесс поступления ионов хлора в ГМК, а активация - наоборот, усиливать их отток из клетки при пассивном перераспределении, характерном для гладких мышц [8], становиться понятна причина развития в первом случае гиперполяризации и, во втором -деполяризации мембраны, достаточной для снижения сократительной активности ГМК.
Действительно, как и показали проведенные исследования, в гиперосмотической среде блокаторы хлорных токов в концентрации 50 мкМ нифлумовая кислота (полностью) и SITS (значительно) угнетали сократительную и электрическую активность ГМК мочеточника морской свинки (Рис.1 Б).
С другой стороны, влияние тех же концентраций используемых блокаторов на электрическую и сократительную активность в растворе Кребса были другими. Например, добавление нифлумовой кислоты приводило сначала к активации сокращения и потенциала действия (ПД) ГМК с последующим исчезновением эффекта к 15-ой минуте инкубации (Рис. 1,В). Лишь увеличение ее концентрации до 100 мкм или времени экспозиции до 20 мин. вызывало достоверное снижение амплитуды сокращения. Действие SITS в концентрации 10-500 мкМ на ПД и сокращения ГМК мочеточника морской свинки проявлялось еще в меньшей степени, чем нифлумовой кислоты, подтверждая общепринятое мнение о незначительном вкладе в электрогенез ГМК хлорной проводимости мембраны [2,9]. Для модуляции хлорной проводимости мембраны
ГМК нами были использованы БАВ, известные своим влиянием на процесс увеличения концентрации внутриклеточных ионов кальция в гладких мышцах (ТЭА и мезатон), что подтвердилось ожидаемой активацией сокращения и ПД ГМК (Рис. 1. Г,Д). На фоне используемых БАВ действие нифлумовой кислоты на электрическую и сократительную активность ГМК мочеточника усиливалось, проявляясь уже в концентрации 50 мкМ.
Наоборот, на фоне предобработки ГМК 10 мкМ ингибитора Na+,K+,2ClI- котранспорта буметанида, наблюдалось отсутствие эффектов нифлумовой кислоты даже при концентрации 200 мкМ (Рис.1,Е).
Полученные данные указывают на то, что одним из механизмов влияния стимуляции а1-адрен- и Н1-гистаминэргических рецепторов мембраны ГМК является модуляция хлорных токов, величина которых зависит от электрохимического потенциала для ионов Cl . В свою очередь, влияние Na+,K+,2ClI- котранспорта на электрические и сократительные свойства обусловлено именно изменением хлорной компоненты проводимости мембраны ГМК. По-видимому, Na+,K+,2ClI- котранспорт вовлечен в цГМФ- и Сa2+-зависимую внутриклеточную сигнализацию, а также участвует в объем-чувствительной регуляции сопряжения возбуждения-сокращения ГМК.