Оксид азота по своей химической природе относится к нейтральным двухатомным молекулам, вместе с тем наличие электрона с неспаренным спином придает молекуле NO высокую реакционную способность. Указанные уникальные свойства позволяют NO выступать как в роли физиологического регулятора, так и в качестве одного из компонентов реализации окислительного стресса (ОС). В зависимости от условий и типа клеток оксид азота может обладать, как про-, так и антиапоптотическими свойствами[1]. В связи с этим представляется актуальным изучение NO в качестве регулятора апоптоза основных эффекторных клеток острого воспаления - нейтрофилов.

Материал и методы. Работа основана на результатах обследования 27 здоровых доноров. Материалом для исследования служила периферическая кровь, взятая утром натощак из локтевой вены с помощью стандартных вакуумных систем BD VACUTAINERTM с гепарином. Нейтрофильные лейкоциты выделяли из крови путем центрифугирования на слое фиколла ("Pharmacia" Швеция) плотностью 1,093. Для индукции ОС в клеточные культуры добавляли перекись водорода в конечной концентрации 5,0 ммоль. Клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37° С в условиях 5% СО2.
Для анализа уровня наработки активных форм (АФК) в культуре нейтрофилов был использован краситель с заблокированной флуоресценцией - дихлорфлюоресцеин диацетат (Sigma Aldrich, USA). Образцы анализировали на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция). Содержание апоптотических нейтрофилов оценивали также на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) методом, основанным на определении экспрессии фосфатидилсерина с помощью аннексина V, конъюгированного с FITC ("Catlag", США). Регистрацию содержания внутриклеточного кальция в нейтрофильных лейкоцитах определяли по интенсивности флуоресценции липофильного зонда Fluo 3 AM, связывающего Ca2+ (MP Biomedicals TM). Полученные данные обрабатывали с помощью программы STATISTICA 6.0.

Результаты исследования. Для индукции ОС и выявления роли АФК в регуляции апоп-тотической программы нейтрофилов, клетки, полученные у здоровых доноров, инкубировали в присутствии перекиси водорода.
На фоне воздействия перекиси водорода было выявлено достоверное увеличение уровня внутриклеточной продукции АФК в культуре нейтрофилов по сравнению с аналогичным параметром в интактной культуре. При этом относительное число нейтрофилов, находящихся в стадии реализации апоптотической программы, после воздействия Н2О2 достоверно превышало аналогичный параметр в группе контроля. Анализ внутриклеточной концентрации ионов кальция выявил нарастание последней в нейтрофилах в присутствие перекиси водорода по сравнению с контролем.

Для выявления роли оксида азота в регуляции апоптоза нейтрофилов при ОС in vitro, культуру клеток после добавления перекиси водорода инкубировали с индуктором (L-аргинин) или ингибитором (L-NAME (N ю-nitro-L-arginine methyl ester)) NO-синтазы.
Воздействие L-NAME на культуру нейтрофильных лейкоцитов приводило к усилению внутриклеточной наработки АФК и увеличению внутриклеточного уровня кальция в ней-трофилах по сравнению с контролем. Сравнительная оценка показателей апоптоза нейтро-филов в аннексиновом тесте под влиянием ингибитора продукции NO в клетке позволила установить достоверное увеличение исследуемого параметра относительно контрольных величин.

Для исследования особенностей реализации апоптотической программы нейтрофилов в условиях повышенной наработки NO была использована экспериментальная модель, предполагающая инкубацию нейтрофильных лейкоцитов с L-аргинином.
Анализ уровня внутриклеточной продукции АФК в культуре нейтрофилов при ОС in vitro после воздействия индуктора синтеза NO не выявил достоверного отличия исследуемого показателя от контрольных значений. Добавление L-аргинина в культуру нейтрофильных лейкоцитов на фоне воздействия токсических количеств Н2О2 также не вызывало увеличения концентрации ионов кальция в клетках по сравнению с контролем. Результаты исследования активационного апоптоза нейтрофилов в условиях ОС не позволили выявить различий между культурой нейтрофильных лейкоцитов с индукцией NO-синтазы и контрольной культурой.

Заключение. Таким образом, добавление перекиси в культуру нейтрофильных лейкоцитов приводило к повышению внутриклеточного уровня АФК, что свидетельствует о развитии дисбаланса окислительного метаболизма. Высокий уровень АФК индуцировал увеличение числа клеток вступивших в апоптоз, возможно, за счет пермеабилизации мембран митохондрий с активацией внутреннего пути апоптоза, о чем косвенно свидетельствует увеличение внутриклеточного уровня ионизированного кальция. Выявлено антиапоптотическое влияние NO на суточную культуру нейтрофилов, о чем свидетельствует снижение уровня АФК, концентрации кальция, количества клеток вступивших в апоптоз в клетках, культивируемых совместно с L-аргинином.