Оксид азота считается одним из универсальных регуляторов клеточного и тканевого метаболизма. Так, NO принимает участие в регуляции тонуса сосудов, воздействуя на ион-транспортирующие системы гладкомышечных клеток через внутриклеточные сигнальные пути, влияет на гипотоническую устойчивость эритроцитов, регулирует процесс переноса этими клетками кислорода [2]. Роль NO в регуляции ион-транспортной функции мембраны эритроцитов остается малоизученной. Мембрана эритроцитов содержит только Са2+-активируемые калиевые каналы, благодаря чему красные клетки крови служат естественной моделью для изучения каналов этого типа. Кроме того, данное обстоятельство позволяет проводить исследования на суспензии интактных эритроцитов. Регуляция Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов осуществляется несколькими путями, один из которых связан с присутствующими в мембране эритроцитов фрагментами дыхательной цепи, такими как цитохром b, цитохром c и НАДН-дегидрогеназа [4]. Не исключено, что оксид азота вмешивается в регуляцию Са2+-активируемых калиевых каналов. В связи с этим изучение его роли в регуляции Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов представляется весьма актуальным.
В работе использовалась кровь практически здоровых доноров. Кровь забиралась из локтевой вены утром натощак в пробирки с гепарином (25 ед/мл крови). Для исследования Са2+ - активируемых калиевых каналов был применен метод регистрации мембранного потенциала в суспензии эритроцитов по изменениям рН среды инкубации в присутствии протонофора, основанный на том, что в этих условиях распределение протонов зависит от мембранного потенциала. Добавление кальциевого ионофора А23187 к суспензии клеток, содержащей 10 мкМ СаСl2, приводило к выходу ионов калия и развитию гиперполяризационного ответа (ГО) мембраны эритроцитов. Амплитуда ГО отражала активность Са2+ - активируемых калиевых каналов мембраны этих клеток. Редокс – индуцированную гиперполяризацию эритроцитов получали добавлением к изоосмотической среде, содержащей 10 мкМ CaCl2, 10 мМ аскорбата и последующим введением 20 мкМ Cl-CCP и еще через 2 минуты 0,1 мМ фенозинметосульфата. Электронно-донорная система аскобат – фенозинметосульфат (ФМС) приводит к открыванию Са2+ - активируемых калиевых каналов эритроцитов и выходу ионов калия в среду инкубации. Это позволяет предположить, что наблюдаемые изменения рН среды инкубации в присутствии системы аскорбат - ФМС обусловлены гиперполяризацией мембраны эритроцитов [1].
Нитропруссид натрия (НН) широко используется в качестве источника NO и по своим эффектам достаточно близок к оксиду азота,  в связи с чем часто применяется в экспериментах при изучении влияния NO на клеточном уровне [2]. В проведенных экспериментах для изучения влияния оксида азота на активность Са2+-зависимых калиевых каналов эритроцитов клетки  инкубировали в течение 15 мин в присутствии 10-8 - 10-6 М   нитропруссида натрия. В ряде экспериментов использовался метиленовый синий – ингибитор растворимой формы гуанилатциклазы (ГЦ) в концентрации 10-10 - 10-8 М.  В этом случае эритроциты инкубировали в присутствии этого агента в течение 15 минут.
В ходе проведенных экспериментов было обнаружено, что инкубация эритроцитов здоровых доноров в присутствии нитропруссида натрия приводила к снижению амплитуды ГО, стимулированного А23187. Так, при концентрации НН 10-8, 10-7, 10-6 М амплитуда ГО составила - 33,64 ± 1,26 мВ (n=3), - 34,8 ± 0,97 мВ (n=3) и - 30,74 ± 1,58 мВ (n=3), соответственно, в то время, как контрольное значение этого параметра составило - 36,73 ± 0,89 мВ (n=3, p?0,05). Амплитуда ГО, индуцированного редокс – системой аскорбат – феназинметосульфат, составила - 28,36 ? 0,62 мВ (n=6).  Инкубация эритроцитов в присутствии 10-8, 10-7, 10-6 М  НН вызвала следующие изменения амплитуды ГО: - 32,46 ? 2,9 мВ (n=6, p?0,05), - 31,63 ? 2,06 мВ (n=6), - 29,88 ? 1,54 мВ (n=6), соответственно. Таким образом, нитропруссид натрия в концентрации 10-8 М приводил к значительному повышению амплитуды ГО эритроцитов здоровых доноров, индуцированного редокс – системой аскорбат – ФМС. При увеличении концентрации нитропруссида натрия до 10-7 М амплитуда ГО приближалась к контрольным значениям, и лишь при максимальной из использованных нами концентраций нитропруссида натрия амплитуда ГО снижалась.
Известно, что прямые эффекты NO обусловлены активацией растворимой формы гуанилатциклазы с последующей наработкой цГМФ и стимуляцией цГМФ-зависимой протеинкиназы, которая может приводить к изменению ионной проницаемости путем фосфорилирования белков канала [2, 3]. Нами обнаружено, что инкубация эритроцитов  здоровых доноров в течение 15 мин в присутствии ингибитора гуанилатциклазы - метиленового синего в концентрации10-10 - 10-8   М сопровождалась увеличением амплитуды ГО, стимулированного А23187. Так, при концентрации метиленового синего  10-10, 10-9, 10-8 М этот параметр составил - 42,38 ± 1,37 мВ (n=3), - 45,99 ± 0,83 мВ (n=7), - 45,47 ± 0,43 мВ (n=6) , соответственно, при этом контрольное значение амплитуды ГО мембраны эритроцитов составила - 41,51 ± 0,57 мВ (n=7, p?0,05). В то же время метиленовый синий приводил к снижению амплитуды ГО эритроцитов, индуцированного редокс-системой аскорбат-ФМС. При добавлении в среду инкубации эритроцитов метиленового синего в концентрации 10-10, 10-9, 10-8 М амплитуда ГО составила - 36,47 ± 3,47 мВ (n=2), - 37,41 ? 1,13 мВ (n=2), - 36,83 ? 2,17 мВ (n=2) , соответственно. При данных концентрациях метиленового синего происходило уменьшение амплитуды ГО индуцированного редокс–системой аскорбат-ФМС по сравнению с контрольным значением этого параметра - 39,15 ± 0,72 мВ (n=2, p?0,05). Таким образом, полученные данные свидетельствуют об участии NO в регуляции Ca2+-активируемых К-каналов эритроцитов человека путем активации гуанилатциклазы этих клеток.

Список литературы:
1.    Гюльханданян А. В. Увеличение калиевой и Са2+ - зависимой калиевой проводимости эритроцитов солями тетразолия. Влияние ингибиторов энергетических процессов / А. В Гюльханданян // Биол. мембраны. – 1992. – Т. 9, № 8. – С. 826 - 834.
2.    Клещев А. Л. Биохимические аспекты действия натрия нитропруссида / А. Л. Клещев, М. Л. Демидов, К. Р. Седов // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1994. - Т. 133, № 1. - С. 39 - 43.
Кремено, С. В. Функционирование и регуляция Са2+-активируемых калиевых каналов эритроцитов : Автореф. дисс… канд. мед. наук / С. В. Кремено. - Томск, 2004. - 44с.